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皮肤致敏性动物替代模型探究进展曹玉萍综述，马鹏程 刘维达 审校 随着人们对生存环境及动物保护的热切关注，自动物实验的减少（reduce）、优化（refine）和替代（replace）这一3R原则提出以来，生命科学研究尽量避免使用传统的试验对象---动物，以器官培养、细胞培养、人工器官的构建等等取而代之。在皮肤科领域，各种接触皮肤的外用药物及各类化妆品除了对皮肤起到治疗和美化作用以外，人们十分关注它们是否会给皮肤造成伤害；另外，过敏性皮肤病是十分常见，传统的检测皮肤致敏性的方法主要是以豚鼠为研究对象的最大值实验、封闭型斑贴实验和开放型斑贴实验，以及人体斑贴实验。本文就近年来引起了广泛关注的皮肤致敏性动物替代模型进行了综述。 1减少和优化动物实验的方法 经典的豚鼠相关的检测致敏性的实验方法多是选取20～30只豚鼠，通过涂抹或皮下注射受试物和福氏完全佐剂数十天后，给予激发剂量的受试物，观察豚鼠局部皮肤红斑，结痂，水肿形成等对受试物的致敏性作出评价。 作为替代的小鼠实验方法有鼠耳廓肿胀试验法（mouse ear swelling test，MEST）、非侵入性鼠耳廓肿胀分析法（noninvasive mouse ear swelling assay，MESA）和小鼠局部淋巴结分析法（local lymph node assay，LLNA）。MEST和LLNA均已通过实验室间的验证，推荐为可靠的检测中等到高度致敏物质的方法。1992年经济合作与发展组织（OECD）关于皮肤致敏的相关条例指出MEST和LLNA作为第一阶段的检测手段，一旦两种中的任何一个出现阳性结果，该物质可被认为是潜在的致敏物质，而无须进行豚鼠实验，若为阴性检测结果，则需进一步进行豚鼠实验以进一步验证[1]。 1.1 鼠耳廓肿胀试验法：MEST法出现于20世纪80年代，该方法是预先向小鼠腹部皮内注射福氏完全佐剂，再多次用胶带剥脱法剥离角质层后，涂受试物，10天后，将受试物涂于一侧耳廓，分别记录涂药前后24h及48h耳廓厚度的变化，鼠耳廓肿胀厚度超过20%者判为致敏物[2]。作为一种耗资低、试验周期短、评分客观，可定量的方法替代豚鼠实验用于检测化学物质引起的迟发性接触超敏反应，而且该方法的判断指标不易被受试物颜色干扰，随后推广至光毒反应、光敏反应等。 1.2 非侵入性鼠耳廓肿胀分析法：MESA法作为接触性过敏性皮炎的检测手段，是迟发型超敏反应的模型，基本方法为在小鼠腹部局部涂抹受试物使之致敏，5天后，在耳部皮肤外用同一受试物，在24h，48h，72h后测量耳部的肿胀程度，评估受试物致敏潜能。与MEST法相比，它的优点在于少了很多侵入性的操作，如向小鼠腹部皮下注射福氏完全佐剂、麻醉小鼠、破坏腹部皮肤的角质层屏障等，此外，它还可检测极低浓度的已知致敏物导致接触性致敏性皮炎的潜能，给予小鼠高维生素A饮食时， MESA法的反应强度可放大数倍，可用于弱效致敏物的检测。给予高维生素A饮食时的MESA法可检出一般饮食MESA法和豚鼠实验中出现假阴性物质，MESA法灵敏度高于人体试验，与豚鼠实验相当[3]。 1.3 小鼠局部淋巴结分析法：LLNA法原理是皮肤接触致敏物，在致敏阶段可引起局部引流的淋巴结内T细胞发生活化和增殖。设置高中低三个浓度实验组和赋形剂对照组，每组4～5只小鼠，连续3天在耳背外用受试物，用放射性元素3H标记的胸腺嘧啶核苷由尾静脉注入小鼠体内，5h后处死，取其耳旁淋巴结制成单细胞悬液，测定细胞分裂数，增殖超过3倍以上判为致敏物。该方法进一步减少了动物使用数量，减轻了实验动物的痛苦，经改良后，用无放射性的5-溴-2-脱氧尿苷或荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）代替放射性元素来减少放射性污染。与豚鼠实验、MEST法和人体最大值试验相比，该方法稳定且特异，检测指标客观，且可定量[4-5]。该法早在1990年就获得了ECVAM认证作为皮肤过敏试验的替代方法。虽会出现一定的假阳性率，如对刺激物十二烷基磺酸钠（SDS）反应阳性，但在替代传统的动物试验上具有重大意义和优势[4]。 2完全替代动物实验的方法 在MEST法、MESA法和LLNA法中，尽管以小动物替代了大动物，减少了动物的用量，但对实验动物仍有需求，而动物替代方法的最终目标是要找到合理的方法完全替代实验动物，因此，科学家们一直在寻找各种能替代动物实验的细胞培养方法。 2.1 单种细胞的培养 皮肤变态反应的机制涉及角质形成细胞和Langerhans细胞，在受到外源性物质刺激后，角质形成细胞分泌各种细胞因子，包括IL-1α、TNFα、GM-SCF、IL-8、IFNγ等等。Langerhans细胞接受微环境的刺激，表达各种成熟标记物如CD86、C