糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠干预及对周期蛋白表达影响.docVIP

糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠干预及对周期蛋白表达影响摘要　目的：观察糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠的干预作用及对周期蛋白(PCNA)表达的影响，分析其可能的作用机制，为临床防治糖尿病肾病提供实验依据。方法：通过单侧肾切除合并注射链脲佐茵素(STZ)建立大鼠早期糖尿病肾病模型，随机分为假手术组(S0)、模型组(M)、糖肾Ⅰ号组(TS)、洛汀新即盐酸贝那普利组(B)、糖洛合组(TS+B)各10只。模型成功后给予不同的干预，连续给药8周，末次给药12小时后，采集尿液、血液标本，酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿微量白蛋白(UAlb)和p2一微球蛋白(p2一MG)；全自动生化仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)；摘取右肾，计算肾脏肥大指数(KHI)；免疫组织化学法(IHC)检测肾组织蛋白PCNA的表达。结果：与模型组比较，糖肾Ⅰ号组蛋白排泄量明显减少(P假手术组的50％作为DN大鼠模型成功标准。 2.2　分组及给药方法：模型成功后随机分为模型组(M)、糖肾I号组(TS)、洛汀新组(B)、糖肾Ⅰ号+洛汀新组(TS+B)、假手术组(SO)，每组10只。大鼠给药剂量按照人与动物体表面积法换算。大鼠药量／kg／d等于成人量／kg／d的6.25倍。糖肾Ⅰ号组：以相当于生药27.08g／kg／d液体量，每日灌胃1次；洛汀新组：以相当于干药18.75mg／kg／d粉末，溶于蒸馏水中，每日灌胃1次；糖洛合组：药物用量、用法同上述两组。假手术组及模型组：给予等量生理盐水。连续给药共8周。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。 2.3　观察指标及方法：具体分述于下。 2.3.1　尿微量白蛋白和β2一微球蛋白测定：代谢笼中收集24h尿液标本，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。 2.3.2　肾重及肾脏肥大指数：麻醉后，无菌操作，取右肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，并计算肾脏肥大指数(肾重／体重)。 2.3.3　肾功能：酶法及苦味酸法测定Scr、BUN。 2.3.4　免疫组织化学法检测PCNA：右侧肾脏，沿矢状正中线切开，取1/2肾脏中一小块皮质置人4％多聚甲醛固定液中，备行免疫组织化学法观察。方法：石蜡切片，常规脱蜡至水；0.1mol/L枸橼酸缓冲液高压锅抗原修复；3％H2O2室温封闭20min，蒸馏水冲洗；PBS洗，滴加封闭液，37℃，20min；滴加1：75稀释的小鼠抗大鼠单克隆PCNA抗体(武汉博士德生物工程有限公司生产)单抗4℃过夜；PBS洗，滴加非生物素标记的二抗，37℃，30min；PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。 2.4 统计学处理：数据以均数土标准差(z±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANO-VA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。检验水准设为α=0.05，P0.05)。 3.3　各组大鼠BUN、Scr比较：详见表3。与假手术组比较，模型组和各治疗组Scr、BUN均显著增高(P0.05)；各治疗组间Ser、BUN比较无差异性差异(P0.05)。 3.4　各组大鼠肾脏组织PCNA表达的情况：详见图1、表4。免疫组织化学法染色后，将所制切片在光学显微镜低倍镜下观察细胞核呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在10×20倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，然后取平均值。免疫组织化学法染色结果采取半定量评分：按染色区变化和染色强度分为0～4分，即O分为无染色或染色极弱；1分为局部弱染、染色区75％。PCNA阳性表达主要在细胞核(详见图1)，假手术组PCNA表达较少，模型组呈强阳性表达，大量细胞核呈棕褐色颗粒状，着色较深，各治疗组表达较少。与假手术组比较，模型组和各治疗组PCNA表达均具有显著性差异(P0.01)；与模型组比较，各治疗组PCNA表达显著减少(P0.01)；与洛汀新组比较，糖洛合组PCNA表达具有显著性差异(P0.05)。 4　讨论 糖尿病属于中医“消渴”范畴，糖尿病肾病属于“肾消”范畴，以脾肾亏虚、气阴两虚为病之本，痰瘀互结为病之标，肾络瘀阻贯穿始终。针对本病虚实并见、阴阳并损、本虚标实的病理特点，我们以养阴益气、活血化瘀、清热祛湿立法，组方糖肾Ⅰ号，通过初步临床观察获得较好疗效。糖肾Ⅰ号以怀山药养阴益气，粉葛根生津止渴，黄芪补气升阳，共为君药；猫人参、山慈姑、漏芦、菝葜清热化湿解毒，芡实、莲须固肾收敛，白术、肉苁蓉健脾补肾，共为臣药；天龙、丹参活血化瘀，黄柏清热燥湿为佐药，使补而不滞；牛膝补益肝肾、逐瘀利水、引药下行，为使之用。诸药