胰激肽原酶制备方法及质量控制.docVIP

胰激肽原酶制备方法及质量控制摘要：介绍了胰激肽原酶的制备方法和质量控制，并对其研究与开发的思路进行了讨论。 关键词：胰激肽原酶；制备方法；质量控制 中图分类号：Q556+.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0025-04 激肽原酶（kininogenase，EC 3.4.21.8）是一组具有特异性、局限性蛋白质水解作用的丝氨酸蛋白酶，又称激肽释放酶（kallikrein）。它能使底物激肽原（kininogen） 释放出一类多肽即激肽（kinin），而激肽对体内的血管和平滑肌有明显的作用。 激肽是在结构上相似的一类多肽激素，主要由不同专一性激肽原酶作用于激肽原而产生。以九肽的舒缓激肽（bradykinin）生物活性最强，是由血液中激肽原酶的作用产生的；其次是十肽的胰激肽（kallidin），是由胰腺等组织中的激肽原酶作用于胰激肽原（kallidingogen）产生的。因此，由胰腺制得的激肽原酶称为胰激肽原酶（kallidinogenase）。我国药品标准将英文名定为 pancreatic kininogenase更为一目了然[1，2]。 现对胰激肽原酶的制备方法和质量作一介绍，并对其研究与开发思路进行讨论。 1制备方法 1.1传统工艺 先将0 ℃以下的丙酮加入猪胰脏中，于0 ℃左右脱水，制得干燥粉。用稀醋酸提取干燥粉，提取液加冷丙酮沉淀，乙醚脱脂，得沉淀物。此沉淀物用稀氯化钠溶液溶解，在pH 8过滤，滤液加冷丙酮使浓度达40 %，离心后清液中补加冷丙酮至浓度为60%，离心，洗涤沉淀并干燥即为酶的粗品。 将粗品溶于pH 4.5的稀醋酸盐缓冲液，离心，清液加入弱酸性阳离子树脂吸附，用pH 4.5的氯化钠溶液洗脱，洗脱液透析脱盐，冻干，即得精品[3]。 此工艺可用丙酮脱水及时处理胰脏，保持酶活性，便于贮存，合并批量投料。然后利用pH 8和pH 4.5介质去除部分杂质，再用丙酮分级沉淀得粗品。 胰激肽原酶的等电点为3.9~4.1，在pH 4.5以下不稳定，故在pH 4.5条件下以弱酸性树脂吸附。这里树脂与酶之间的结合部分是离子的，部分是疏水结合[1]。 李立恒等[4]改进了传统工艺。采用加入对酶有激活作用的Ca2+盐酸溶液取代醋酸提取干燥粉，由搅拌树脂吸附，改为柱色谱，明显提高了产品收率和比活。 1.2DEAE-纤维素吸附工艺 丙酮制成干燥粉，用稀醋酸钠（pH 6，内含CaCl2）提取，离心，上清液55 ℃处理5 min，离心去沉淀，用氢氧化钠调pH至7，加丙酮沉淀、抽滤，滤液加水稀释。 在稀释液中加DEAE-纤维素（pH 7磷酸盐缓冲液平衡）吸附，氯化铵溶液洗脱，洗脱液用冷丙酮70%浓度沉淀，干燥得粗品。 粗品溶解后调pH至5，上DEAE-纤维素色谱柱（pH 5醋酸钠缓冲液平衡）,用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，收集酶活性部分，减压浓缩，对蒸馏水透析。 透析液调pH至6.7，上DEAE-Sepharose CL-6B柱（pH 6.7醋酸钠缓冲液平衡），用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，得2个活性峰，减压浓缩，蒸馏水透析，真空干燥得产品[5]。 此工艺是使介质的pH大于酶的等电点，用阴离子交换树脂利用不同pH进行纯化。从生产的角度，笔者认为可省去DEAE-Sepharose CL-6B色谱步骤，因为该酶产品不需将两种活性成分分离。 对上述两种工艺加以分析，可以看出：（1）利用不同pH介质，用离子交换剂进行纯化是适当的。随着近年不断推出新的离子交换剂，宜选用更适当的吸附剂；（2）早年用透析去掉小分子杂质效率较低，可改用大型超滤设备，既可去掉小分子杂质，又可达到浓缩的目的；（3）在以胰脏为原料的生产过程中，Ca2+既有激活酶的作用，又有稳定酶的效果，是常规的步骤之一；（4）实验室操作用柱色谱比静态吸附效果好，而生产中因当然静态吸附有时效率较高，用什么方式应视具体生产情况而定。 张建新等[6]报道，用离子交换色谱法制备高纯度酶，其特点是上样量较大，在纯化过程中流速较快，纯化中间体只需一步即可达到质量标准的要求，但该文未报道所用交换剂的型号。 汪晓英等[7]报道的制备方法基本流程与周祖荫等[5]的类似，部分条件有些差异，也是以DEAE-纤维素为交换剂。 1.3盐析与疏水色谱相结合工艺 将胰激肽原酶粗品溶于10 %饱和度的硫酸铵溶液，离心取上清液，加入硫酸铵粉末使溶液达到35 %饱和度，再离心取上清液，加入硫酸铵达70 %饱和度，离心，沉淀溶解后进行疏水色谱。 以Buty1 Sepharose FF为介质；平衡缓冲液为10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4+1.0 mo