脾阴虚证大鼠模型心脏组织MAPK信号转导及调控探究.docVIP

脾阴虚证大鼠模型心脏组织MAPK信号转导及调控探究李　丹　李德新　崔家鹏　刘 进　朱爱松 摘　要：目的：通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化，探讨在脾阴虚状态下大鼠心脏组织MAPK活性变化规律及其调控机制，进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用，从而为脾实质的研究提供客观依据。方法：采用饮食不节、疲劳过度和药物损伤复合造模法塑造脾阴虚证动物模型。采用免疫沉淀法检测心脏组织中MAPK活性。结果：脾阴虚证模型组与正常对照组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.05)，脾阴虚证治疗组与正常对照组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.01)，与脾阴虚证模型组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.01)。结论：脾阴虚证状态下，大鼠心脏组织MAPK参与的细胞信号转导发生改变。滋脾阴方药能有效调控脾阴虚证大鼠心脏组织MAPK活性变化，可能为滋脾阴方药作用机制之一。 关键词：脾阴虚证；MAPK；滋脾阴方药 中图分类号：R33 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1385－03 现代科学认为，细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞信号转导是机体内一部分细胞发出信号，另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程，生命现象的发生实际上都是机体内外信号传递的结果。在多条信号通路中，有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated pro-tein kinase，MAPK)信号转导通路是多种信号转导途径的共同作用部位，在多种信号传递途径中均具有关键性作用。因此探讨脾虚状态下MAPK信号转导通路的变化规律具有重要的意义。本项研究通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化，探讨在脾阴虚状态下大鼠心脏组织MAPK活性变化规律及其调控机制，进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用，从而为脾实质的研究提供客刃已依据。 1 材料与方法 1．1 实验动物分组及造模实验选用3月龄健康SD大白鼠60只(由辽宁中医药大学实验动物中心提供)，雌雄各半，平均体重(195±20)g。随机分为3组：正常对照组、脾阴虚证模型组、脾阴虚证治疗组。实验第1－25天为造模阶段，采用目前公认的复合因素造模方法，即在过劳加饥饱失常方法造成脾气虚证的基础上，造成脾阴虚证动物模型。 1．2 治疗及药物从实验的第26－89天，脾阴虚证模型组停止施加造模因素，对脾阴虚证治疗组给予拟定的滋脾阴方药(一次性购于辽宁中医药大学附属医院)，浓度为每100mL药液含生药100g，每日每只1.55mL/100g体重，胃饲。其他各组每日采用生理盐水3mL/只，胃饲。 1．3 主要试剂及仪器主要试剂：MBP(Sigma公司)，[γ－32P]ATP(北京亚辉生物医学工程公司)，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其他为国产分析纯。主要仪器：MR1822型低温高速离心机(法国)，Beckman LS－180液闪仪(USA)。 1．4 标本制备实验第90天，20％乌拉坦腹腔注射麻醉(0.4mL/100g体重)，断头取心脏组织，置于－70℃低温冰箱中保存备检。取0.1g心肌组织，加入0.6mL BufferA粉碎缓冲液(100mL含2mM EDTA，10mM EGTA，20mMTrisHC1 pH7.5，0.25M蔗糖)，剪碎，匀浆，超声粉碎(5s/，次，间隔38，共10次)，4℃15000r/min离心1h，上清液为细胞浆蛋白。 1．5 检测方法(免疫沉淀法)及主要程序 将20μL样品与含MBP(1mfmL)的25μL激酶缓冲液[20mmol/LHEPES，pH7.2，10mmol/L MgCl2，2mmol/L MnCl2，2mmoL/LDTT，0.5mmol/L NaVO4，0.1mg/mL BSA，2mmol/L蛋白激酶抑制剂，2.0μCiγ－32P－ATP(1×106cpm)]，30℃震荡反应15min，取10μL反应液滴在Whatman P81离子交换滤纸上晾干，用75mmol/L磷酸洗3次，每次2min，取出吹干，将滤膜放入含10mL蒸馏水的液闪瓶中，以Beckman闪烁计数仪测定其放射活性。MAPK活性以比活性表示。比活性表示30℃时每mg蛋白质每分钟催化[γ－32P]－ATP掺入底物蛋白的pmol量。 1．6 数据统计处理所有数据用x±s表示。实验结果采用SPSS软件11.0版本进行处理。 2 结　果 脾阴虚证大鼠心脏组织的MAPK活性变化(见表1)。方差分析结果表明，脾阴虚证大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性变化有统计学意义。脾阴虚证模型组心脏组织的细胞浆MAPK活性升高明显，滋脾阴方药能显著升高脾阴虚证治疗组大鼠心脏组织