血管紧张素Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖影响.docVIP

血管紧张素Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖影响目的：探讨血管紧张素Ⅱ及其Ⅰ型受体(AT1)拮抗剂洛沙坦(losartan)对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的影响。方法：体外分离培养增生性瘢痕戍纤维细胞，在不同浓度的血管紧张素Ⅱ、losartan、PD123319作用下，观察成纤维细胞的生长情况，并绘制生长曲线，采用MTT法和3H－TDR掺入释放法分别检测成纤维细胞增殖和DNA含量的情况。结果：血管紧张素Ⅱ在浓度为10-8Smol/L～10-5mol/L时，成纤维细胞的细胞数量明显增多，DNA含量增加(P＜0.05)；losartan能几乎完全抑制AngⅡ的这种作用，PD123319对此作用几乎没有影响。结论：AngⅡ可促增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，该作用主要通过AngⅡ的Ⅰ型受体介导完成，AT1的拮抗剂有望在增生性瘢痕防治中发挥重要作用。 [关键词]血管紧张素Ⅱ；洛沙坦；细胞增殖；增生性瘢痕；成纤维细胞 [中图分类号]Q343.6　[文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0298－04 增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和胶原蛋白无序沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素Ⅱ(an－giotensin Ⅱ，AngⅡ)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子，通过内分泌、旁分泌和自分泌等方式发挥其多种生物功能。其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。目前越来越多的研究结果认为Ang Ⅱ作为一种生长因子，是一种强烈的有丝分裂原，在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。本研究的目的在于观察Ang Ⅱ及其Ⅰ型受体拮抗剂洛沙坦(losartan)对来源于人类增生性瘢痕成纤维细胞的生长和增殖的影响，为探索增生性瘢痕的发生机制及防治方法提供资料。 1　材料和方法 1．1　主要试剂：Ang Ⅱ、Losartan、PD123319(美国Sigma)；DMEM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Hyclone)；3H－TDR(北京原子能研究所)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Serva分装)；医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ－875型)；CO2培养箱(美国SHEL－LAB1815TC型)。 1．2　取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗；②病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病；③病人无全身感染、肿瘤；④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未全身应用皮质类固醇等药物治疗；⑤瘢痕局部症状典型。 1．3　实验分组：实验分为四组：①对照组：20％新生小牛血清的DMEM培养液：②Ang Ⅱ组：培养液中加入Ang Ⅱ，浓度范围10％-9mol/L～10-5mol/L；③Ang Ⅱ+losartan组：培养液中先加入lO-9mol/L～10-5mol/L的losartan预处理30min，再加入同浓度AngⅡ；④AngⅡ+PD123319组：培养液中先加入10-9mol/L～10-5mol/L的PD123319预处理30min，再加入同浓度AngⅡ。 1．4　成纤维细胞分离、培养：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3～4天换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，此后每2～3天换液1次，每4～5天分种传代1次，实验用第3～5代细胞。 1．5　绘制成纤维细胞的生长曲线：取成纤维细胞以5×104个/ml的密度接种于24孔细胞培养板，每孔含有0.5ml的培养液，待其铺满培养板80％时，换成含0.5％小牛血清的DMEM培养液，再分别加入不同浓度的Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan,Ang Ⅱ+PD123319，每一浓度设三个复孔，并设立只加入培养基的对照组。培养24h后用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，分别收集各孔细胞，用PBS洗涤后计数。 1．6　Ang Ⅱ和losartan对成纤维细胞增殖的影响：用MTT法测定成纤维细胞的增殖情况，取对数生长期的细胞，细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板。每孔含150μl的培养液，待细胞贴壁后，换成含10％小牛血清的DMEM培养液，再分别加入不同浓度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123