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超声波辅助提取猪胆红素技术条件探究摘要：目的研究从猪胆汁中用超声波技术辅助提取胆红素的方法。方法考察超声波功率、频率、处理时间及处理温度等因素对胆红素提取的影响，通过SAS8.2统计系统分析正交试验结果。结果优化后的工艺条件为：超声波功率320W，频率72kHz，处理温度30℃，处理时间20min时，胆红素提取率提高15％。结论超声波处理能提高胆汁中胆红素提取率。 关键词：猪胆汁；猪胆红素；超声波；提取 中图分类号：R282.74文献标识码：A文章编号： 1672?979X(2009)07?0029?04 胆汁是肝脏的分泌物，贮存于胆囊中。胆红素(bilirubin，BR)是胆汁的成分之一，是含侧吡咯环的直链化合物，属二烯胆素类[1]，分为游离胆红素和结合胆红素。游离胆红素相对分子质量为584.65，含量较少；胆红素在葡糖醛酸基移换酶催化下转化为结合胆红素(主要是胆红素双葡糖醛酸苷)，相对分子质量为937，是胆红素的主要存在方式[2]，有促进红细胞新生、降低血压、抑制心脏跳动和呼吸等作用[3]。 从动物胆汁中提取胆红素的技术[4]主要有钙盐法，树脂法和快速法。钙盐法是传统方法，操作繁琐，收率低；树脂法提取纯度较高，但生产成本高，操作复杂；快速法操作简单，成本较低，是目前广泛应用的方法。超声波提取是目前国内外正在研究开发的一种辅助提取方法，超声波具有较强的空化作用使物质不断运动，超声波次级效应如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等能加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取[5]。我们将超声波技术用于胆汁中胆红素的提取，探索提高胆红素提取率的新方法。 1材料与方法 1.1原料与试剂 胆红素对照品(中国药品生物制品检定所)；猪胆(大庆金锣食品公司)；二氯甲烷，无水乙醇，浓盐酸，对氨基苯磺酸，亚硝酸钠均为分析纯。 1.2仪器与设备 JBT/C?YCL400/3P(D)可调式超声波药品处理机(济宁金百特电子公司)；722型分光光度计(上海精密科学仪器公司)；DK?S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器公司)。 1.3胆红素的测定方法 1.3.1标准曲线的绘制精密称取胆红素对照品10.0mg，用二氯甲烷溶于100mL棕色容量瓶中。取10.0mL于50mL棕色容量瓶中，用95％乙醇稀释至刻度，每1mL溶液含0.02mg胆红素。准确吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于具塞试管中，分别加入95％乙醇9.0，8.0，7.0，6.0，5.0，4.0mL，再各加重氮化试剂1.0mL，摇匀，静置室温暗处1h，在波长520nm处测吸光度，以吸光度A(Y)为纵坐标，所含胆红素浓度(X)为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线[6]。 1.3.2胆汁中胆红素的测定将新鲜胆汁置于试管中并水浴微热，取10.0mL置入100mL棕色容量瓶中，用氯仿、乙醇混合液(4[JX-*4]:[JX*4]6)稀释至刻度，取10.0mL置入具塞试管中，加8mL乙醇及1.0mL重氮化试剂，摇匀，静置室温暗处1h，在波长520nm处测吸光度，由测定的吸光度从标准曲线上查得胆红素的毫克数，按下式计算胆汁中胆红素含量(g/mL)。 胆汁中胆红素含量=标准曲线上查得的毫克数×10／1000 1.4单因素试验方法 影响超声波辅助提取的因素包括功率、频率、作用温度、作用时间、样品处理浓度等。选取不同的功率、频率、处理时间、处理温度等4项因素进行单因素分析。各单因素试验数据依据以往试验基础设计为不同水平：(1)超声功率分别为320W和220W；(2)超声频率为24，30，46，52，68，70，72，74kHz8个水平；(3)超声处理时间为5，10，15，20，25，30min7个水平；(4)处理温度为20，25，30，35，40，45℃6个水平。 1.5多因素正交试验 根据超声频率、超声时间、超声温度等单因素试验所确定的最佳范围值，用正交试验L9(33)方法，以胆红素提高量为指标，进行多因素交叉组合试验。 2结果与分析 2.1胆红素测定标准曲线 胆红素含量在0.002～0.01mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，回归方程：Y=0.0907X-0.0927，r=0.9998。 2.2单因素试验结果 2.2.1超声波功率对胆红素提取率的影响准确称取2份处理后的胆汁各50mL，频率70kHz，20℃超声处理20min，测定胆汁中胆红素含量，结果220W时胆红素的含量0.371‰，320W时胆红素的含量0.426‰，胆红素含量显著不同，320W时胆红素的提取率提高。这是由于220W，超声强度没有达到空化阀声压，空化作用不强，物质作用不剧烈