针刺对痛经大鼠中枢及外周β-EP含量影响.docVIP

针刺对痛经大鼠中枢及外周β-EP含量影响关键词 针刺疗法 原发性痛经 缝隙连接蛋白43 β内啡肽 RNA干扰技术 大鼠 RNA干扰（RNAi）技术作为一种新的反义基因工具,较以往的重组反义DNA,反义寡聚脱氧核糖核苷酸的效率更高,细胞内少许siRNA分子就能发挥显著基因下调作用[1]。前期研究工作表明[2-3]，缝隙连接蛋白43（Cx43）与经络密切相关，那么沉默穴位局部Cx43的表达，对经络信号的传导有无影响，是本课题研究的重点。痛经是青春期妇女的常见病之一,发病率为42%～90%。针刺是治疗原发性痛经的有效方法，但对其镇痛机制尚缺乏有力的实验依据。为继续深入探讨Cx43与穴位――经络――针刺效应的关系，及针刺的镇痛机制，本实验利用RNAi技术沉默穴位局部Cx43的表达，以催产素所致大鼠子宫剧烈收缩为模型，观察针刺对痛经大鼠下丘脑、垂体、卵巢及外周血β-EP水平的影响。 1 材料与方法 1．1 实验动物:选用健康、雌性、未孕SD大鼠50只，体重180~210g，由同济医学院实验动物中心提供。保持动物在室温、昼夜节律条件下，自由饮水、进食。 1．2 实验药物及试剂:己烯雌酚（合肥久联制药公司）。缩宫素注射液（上海禾丰制药公司）。无内毒素质粒抽提试剂盒由天根生化科技有限公司。β-EP放射免疫分析试剂盒由中国人民解放军第二军医大学提供。Trizol RNA抽提试剂（美国Gibcobr），M-MLV逆转录酶及反应缓冲液、dNTPs、Oligo dT、RNasin酶抑制剂（美国Promega），PCR Marker（美国Ferment）。Cx43 mRNA及β-actin引物由上海生工生物技术公司合成，兔抗鼠Cx43抗体，加拿大Chemicon产品。β-actin单克隆抗体，武汉晶美公司。 1．3 实验方法:①质粒构建、提取与纯化:干扰质粒pSilencer-Connexin43-shRNA，阴性对照质粒pSilencer-Control-shRNA由本实验构建，含有U6启动子、G418抗性、kana抗性及多克隆位点等。根据siRNA设计的有关原则[4-5]，针对大鼠Cx43mRNA序列，确定siRNA作用靶序列（AACAGTCTGCCTTTCGCTGTA），344-364，及一个无关序列（GACTTCATAAGGCGCATGC）。用鉴定正确的质粒转化感受态细菌DH5α，挑取单克隆菌落进行小量扩增，提取质粒酶切鉴定正确后，再行大量扩增（质粒抽提试剂盒），灭菌PBS（PH8．0）溶解后冻存于-20℃备用。②动物分组及干预方法:将动物按体重分层，然后按完全随机分为正常组（N）、痛经模型组（M）、针刺组（A）、针刺+干扰组（A+I）、针刺+干扰对照组（A+IC），共5组，每组10只。其中A+I、A+IC均在造模的第5、7、9、11天于针刺穴位处,分别局部高压注射干扰质粒和阴性对照质粒，20mg/每穴，其余处理与A组相同。造模方法:M、A、A+I、A+IC，均用己烯雌酚(1%的羟甲基纤维素钠配成悬混液)灌胃，每日3mg/kg，连续12d，再于末次给药1h后，腹腔注射缩宫素14U/kg。正常组用生理盐水灌胃，容积0．2ml/10g，连续12d。干预方法:A、A+I、A+IC以自制布袋固定，于造模第5天针刺三阴交、地机、关元(根椐华兴邦等研制的大鼠穴位图谱及比较解剖学原理取穴)，每次留针30min，每隔5min捻转30s，每日1次，连续7天。 1．4 观察项目与检测方法:①扭体反应发生率观察:各组在末次给药1h后，腹腔注射缩宫素14U/kg，诱发扭体反应为子宫收缩(痛经)的指标，观察并记录30min内每只大鼠扭体次数，及扭体潜伏期。②穴位处Cx43mRNA及蛋白的检测:取穴位处的皮肤肌肉组织采用Trizol一步法抽提总RNA，在核酸分析仪上检测RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒提供的实验步骤进行逆转录反应。取3μlcDNA依次加入10×buffer、2M dNTP、10μM Primer 2μl，Taq酶1U，补水至总体积25μl，分别进入PCR循环。循环条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，55℃退火30s,72℃延伸1min。共35个循环，循环终末72℃8min终止反应。取PCR产物8μl，用1．5%琼脂糖凝胶进行DNA电泳，电泳条带结果采用自动凝胶图像分析仪分析，计算目的产物与β-actin的光吸收度积分比值。以积分值作为Cx43表达的半定量指标。取穴位处皮肤肌肉组织用组织裂解液裂解并匀浆，然后在4℃15000r/min,离心30min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，取各组样品50μg蛋白质，以12%的SDS胶分离蛋白。然后采用湿转法（300mA，0．5h）将蛋白质转移至PVDF膜上