针刺对实验性快速性心律失常大鼠心肌GimRNA表达影响.docVIP

针刺对实验性快速性心律失常大鼠心肌GimRNA表达影响(1．辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032；2．解放军93303部队卫生队，辽宁沈阳110043；3．辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032) 摘要：目的：探讨针刺内关穴调节快速性心律失常的效应机理。方法：电针鸟头碱所致的快速性心律失常模型大鼠双侧“内关”穴，观察针刺前后心律(率)变化；用半定量逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)方法测定心肌中抑制性G蛋白(Gi)mRNA的相对含量。结果：针刺治疗组与模型组相比有显著变化(P＜0.05)。结论：快速性心律失常可能和心肌中G蛋白基因表达障碍有关；G蛋白在针刺内关穴对心律失常的调节中有重要作用。 关键词：针刺；内关；心律失常；心肌；抑制性G蛋白；RT－PCR 中图分类号：R-33　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-0945-02 心律失常是临床常见病证，发病机制复杂。临床资料和实验表明针刺内关穴对心律失常的疗效确切。G蛋白是生物信息转导过程关键的中介体，可以耦联多种受体和效应器，引起一系列细胞“瀑布”效应。本实验通过对大鼠心肌Gj(Gi2、Gi3)mRNA表达的观察，旨在初步探讨G蛋白在针刺内关穴对快速性心律失常调节的信号转导通路中有重要作用，为临床针灸治疗心律失常提供理论依据。 1材料与方法 1.1实验动物与分组　健康成年Wistar大鼠40只，雌雄不拘，由沈阳药科大学实验动物中心提供(Ⅰ级，批号：0001315)，体重(200±50)g。在本校实验动物中心饲养1周，以适应环境。随机分为4组，每组10只。即正常组(A)；乌头碱造模组(B)(乌头碱造模不针刺)；乌头碱“内关”穴组(C)(乌头碱造模加针刺“内关”穴)；乌头碱“非经非穴”组(D)(乌头碱造模加针刺“非经非穴”)。 1.2试剂与仪器　乌头碱(批号：110720-200410，购于中国药品生物制品检定所)。组织总RNA试剂盒、RT-PCR试剂盒、Gi2mRNA和Gi3mRNA引物、甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(均由大连宝生物工程有限公司合成提供)；蛋白核酸分析仪(DU－600)；PCR仪(PE9600)；电泳仪(EPS－300)；凝胶成像分析系统(GISl20D)；电针仪(C6805－A)等。 1.3动物模型的制备　20％氨基甲酸乙酯(5mL/kg)腹腔注射麻醉，于舌下静脉注射0.002％的乌头碱(1mL/kg)。以心电图出现室性早搏二联律、室性心动过速等心律失常波形为造模成功标志。 1.4电针方法及取材　根据《实验针灸学》大鼠针灸穴位取“内关”穴，非经非穴点取大鼠肩三角肌隆起处。用0.5寸毫针(φ0.25mm)直刺2～3mm，加电针(疏密波，频率2～20Hz。强度2～3mA；或以大鼠前肢微颤为宜)，行针10min，记录心电图。后立即开胸取出心脏，置于0℃冰盐水中，取50mg左心室放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理过的EP管中，－70℃冷冻备用。取材时间均在尚未恢复正常心律时。 1.5心率测定方法　大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，用MS2000多媒体化生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入四肢末端及剑突皮下，分别记录A组、B组给药后和C、D两组针刺后心电图，取连续10个心电周期计算平均值做为实验大鼠的心率。 1.6逆转录一聚合酶链反应　组织总RNA提取：取组织标本，按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，用蛋白核酸分析仪分析其纯度OD260/280，各样本均在1.9-2.0之间。逆转录：取1μg RNA按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，经30次循环后将产物保存在-70℃冰箱中备用。PCR扩增反应：PCR反应体系：逆转录产物20μL，上下游引物各1μL，MgSO 46μL，5×Buffer 16μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dH20 55.5μL，总反应体系100μL。按照以下步骤进行扩增：94℃ 30s，56℃30s，72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸5min。选择GAPDH(528bp)作为内参与上述反应体系相同。产物分析：取12.5μL PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳1h，EB染色，紫外透射仪观察，应用凝胶图象处理系统扫描摄像各条带的光密度，以GAPDH产物的光密度值作为内参，计算不同条件下Gi2(Gi3)mRNA/GAPDH扩增量的比值进行半定量分析。此比值为Gi2mRNA、Gi3mRNA的相对表达量。 1.7统计学方法　实验数据用均值(x)±标准差(s)表示，用SPSSl0.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析F检验。 2结果 2.1Gi2 Gi3的序列测定结果　所测得的G