鸡血中抗菌肽提取、纯化及抑菌效果检测.docVIP

鸡血中抗菌肽提取、纯化及抑菌效果检测摘　要：收集新鲜鸡血后迅速抗凝，反复冻融后研磨制成血粉，加入适量磷酸盐缓冲液，然后超声波细胞萃取，将所得的匀浆混合物至于50mL离心管中，70℃水浴，30min后加入等体积的饱和硫酸铵，4℃ 10000r/min离心20min，取出沉淀，装入透析袋，用蒸馏水透析，其间每隔一段时间更换一次蒸馏水，用萘氏试剂检测，直至没有NH4+全部析出，无砖红色沉淀为止，所得物即为抗菌肽的粗提物。再经葡萄糖凝胶G-200处理纯化样本，并且测定纯化后样本的抑菌活性（菌体选用大肠杆菌）。结果表明，粗提物和纯化物对大肠杆菌等均有明显的抗菌作用。 关键词: 鸡血 粗提物 葡聚糖凝胶处理 抑菌活性 抗菌肽（antibacterial peptides）是在诱导条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是生物天然免疫系统中的一个重要组成部分,具有杀灭病菌、保护机体的作用，原核生物、植物、动物都可产生由基因编码、核糖体合成的抗菌肽。抗菌肽具有高效、抗光谱微生物活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均产生较强的杀伤作用。由于抗菌肽分子的两亲性结构和正电荷可使其在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子通道，造成细菌细胞质膜结构破坏，引起细胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致细胞死亡。这种独特的抗菌机制不会使病原微生物菌株变异而产生抗药性，而且对机体无毒副作用。这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手难题提供新途径。 目前，我国鸡的饲养量很大，屠宰鸡的下脚料鸡血很多，对其进行抗菌肽的提取和研究，是对资源的利用和再开发，是很有必要的。 1.材料与方法 1.1材料 新鲜鸡血：天津市北辰区养殖发展服务中心提供。 大肠杆菌: 由天津市畜牧兽医站细菌室提供。 1.2主要仪器、试剂 仪器：高温冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ型）；紫外光可见分光光度计（752）；电子天平（JT3101N）：自动部分收集器（BSZ）；恒温振荡仪；台式离心机；水浴锅；超净台；冷冻干燥机。 试剂：5%柠檬酸；葡聚糖凝胶（Sephadex G-200）；0.5mol/mL的乙酸铵洗脱液；磷酸缓冲液（0.02 mol/L, pH6.0）；硫酸铵固体粉末；灭菌水；青霉素；胰蛋白胨；酵母提取物；琼脂粉；NaCl；萘氏试剂等。 1.3方法 1.3.1样品的处理 收集新鲜鸡血后迅速抗凝，反复冻融后研磨制成血粉，加入适量磷酸盐缓冲液，然后超声波细胞萃取，将所得的匀浆混合物置于50mL离心管中，70℃水浴，30min后加入等体积的饱和硫酸铵于4 ℃ 10000r/min离心20min，取出沉淀，装入透析袋，用蒸馏水透析，其间每隔一段时间更换一次蒸馏水，用萘氏试剂检测，直至没有NH4+全部析出，无砖红色沉淀为止。得到的物质即为抗菌肽的粗提物。 1.3.2样品的纯化 抗菌肽的粗提物采用葡聚糖凝胶（Sephadex G-200）纯化，并用0.5mol/mL的乙酸铵洗脱液收集，控制流速为3mL/10min，在280nm波长下测定收集液的光吸收值，筛选出蛋白质浓度处于峰值的试管液，然后将其冷冻干燥后备用。 将冷冻备用的样品收集液装入透析袋中，先用0.5mol/mL的乙酸铵缓冲夜浸泡，间隔30～60 min更换一次浸液，大约更换2～3次后，再用聚乙二醇（分子量20000）覆盖，置于4 ℃冰箱内，不仅析出杂蛋白，还可以除去分子量小于分子量20000以下的蛋白。 1.3.3抑菌效果检测 采用LB培养基，将青霉素配成1000单位、2000单位、4000单位和6000单位的青霉素剃度溶液留做备用。用牛津杯法检测，同时加入50μL阳性对照以及阴性对照(2000U/mL的青霉素作为阳性对照，提取液作为阴性对照)，37℃培养过夜。 2.结果与分析 据纯化物的吸光光度值，4、5、6号管为峰1，收集在一个烧杯中；18、19、20、21号管为峰2，收集在另一个烧杯中，然后进行冷冻干燥。纯化物吸光光度值见表1，峰值图见图1。 据青霉素梯度实验，6000单位的青霉素抑菌圈最大，直径约为1.2cm，抑菌实验选用6000单位的青霉素做对照。青霉素梯度实验图见图2。 据抑菌实验，6000单位的青霉素抑菌圈直径为1.1cm，粗提物抑菌圈直径为1.4cm，纯化物抑菌圈直径为1.8cm。结果表明，纯化物的抑菌效果高于6000单位青霉素的抑菌效果（菌体采用大肠杆菌），粗提物和纯化物对大肠杆菌均有着较强的抑菌效果。抑菌实验图见图3。 3.讨论 国内外最广泛使用的分离抗菌方法是化学试剂提取法，本研究首先使用饱和硫酸铵溶液溶解红细胞，加入适量磷酸盐缓冲液，然后超声波细胞萃取，内部物质释放出来，将所得的匀浆混