鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞金属蛋白酶mRNA表达影响.docVIP

鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞金属蛋白酶mRNA表达影响摘 要 目的：在家兔膝关节骨性关节炎模型的基础上观察鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞的影响。方法：随机分成两组，实验组建立Hulth骨性关节炎模型，对照组仅行双侧膝关节切开术，以建立模型。以正常新西兰大白兔膝关节软骨为正常对照组，以鹿茸多肽为实验药，法滋隆为阳性对照药。分别进行MTT法检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及琼脂糖电泳检测，获取前后软骨细胞核酸中金属蛋白酶表达情况。结果：鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞具有促进增殖作用；骨性节炎软骨细胞直接分泌到胞外的金属蛋白酶含量变化不明显；骨性关节炎软骨细胞核酸中金属蛋白酶出现高表达。结论：骨性关节炎软骨细胞在软骨细胞正常分化及增殖发生改变的过程中，骨性关节炎软骨基质降解可能是金属蛋白酶与其他因子协同作用的结果；鹿茸多肽可促进骨性关节炎软骨细胞增殖，并可抑制骨性关节炎软骨细胞中金属蛋白酶的过度表达，可能对治疗骨性关节炎有较好的作用。? 关键词 骨性关节炎 金属蛋白酶 软骨细胞? 试剂、仪器及实验材料 ? 主要试剂：①化学试剂：碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、考马斯亮兰、MTT、甘氨酸、Tris、SDS、TEMED、二甲基亚砜。②细胞培养试剂与培养板。③聚合酶链式反应（PCR）试剂：RNA提取试剂盒，RNA PCR相关试剂盒。主要仪器：（略）? 实验材料：新西兰大白兔，鹿茸多肽，骨肽注射液。? 实验方法? 动物模型及分组：雄性新西兰白兔8只，3～5个月龄，体重2.5～3.5kg，平均2.85kg。按组间均衡一致的原则随机分为两组，每组4只。采用内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板Hulth骨性关节炎模型，实验组均行内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板；对照组仅行侧膝关节切开术，但不行前交叉韧带切断并切除内侧半月板术。? MTT法检测鹿茸多肽对软骨细胞生长的影响，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨细胞分泌金属蛋白酶，RT-PCR法检测软骨细胞中金属蛋白酶mRNA表达。? 统计学方法：均值间差异比较采用组间?t?检验，数据统计以（?X[TX-]±S?）表示。? 结果与分析? 鹿茸多肽对兔骨关节炎软骨细胞增殖的影响：10μg/ml、50μg/ml的鹿茸多肽均不影响软骨细胞的活性，而在72小时内100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml的鹿茸多肽对软骨细胞的增殖均有促进作用，与对照组有显著性差异（P0.05、P0.01）。依据实验原则（用量最小，疗效最好），判定100μg/ml为促进软骨细胞增殖的最佳药物作用浓度。? SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨细胞分泌金属蛋白酶：金属蛋白酶1、3在正常、骨性关节炎软骨细胞及不同浓度鹿茸多肽作用软骨细胞分泌的胞外基质中未见异常表达。? RT-PCR法检测软骨细胞中金属蛋白酶mRNA表达实验结果：金属蛋白酶1、3在正常软骨细胞核酸中未见明显表达，而在骨性关节炎软骨细胞中其含量却出现高表达，并且在经鹿茸多肽、法滋隆作用后的骨性关节炎软骨细胞核酸中未见金属蛋白酶1、3表达。? 讨 论? 骨性关节炎中关节软骨进行性破坏和丧失的机制还不清楚，但其病理过程可划分为三个相互交叉的阶段，即软骨基质的改变，软骨细胞对组织损伤的改变，软骨细胞合成代谢衰退及软骨组织的进行性丧失［1］。可见，软骨细胞作为关节软骨中惟一一种细胞，其功能决定着骨性关节炎的转归，软骨细胞功能的异常是骨性关节炎变化的开始和关键［2］。软骨细胞发生损伤后，受损的软骨细胞发生变性，使软骨细胞细胞周期发生变化，细胞内合成调控机制发生改变，使正常软骨细胞代谢发生改变，增生修复与降解出现紊乱，最终导致骨性关节炎的发生。? 鹿茸多肽对软骨细胞生长的影响［3］：本实验研究发现，低剂量鹿茸多肽促进软骨细胞增殖的作用并不明显，中、高剂量鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞具有显著促进作用。? 鹿茸多肽作用前后软骨细胞分泌到胞外基质及胞内产生的金属蛋白酶表达的比较：本实验发现，金属蛋白酶1、3在正常及骨性关节炎软骨细胞和鹿茸多肽作用后正常及骨性关节炎软骨细胞分泌的胞外基质中，均未见异常表达；而在骨性关节炎软骨细胞核酸中，金属蛋白酶1、3均出现高表达，并且在鹿茸多肽及法滋隆作用后骨性关节炎软骨细胞核酸中，金属蛋白酶1、3均受到明显抑制。出现此种现象的原因可能为：金属蛋白酶胞外分泌的含量低，或被金属蛋白酶抑制剂-1结合；缺乏细胞因子或生长因子的协同作用，细胞因子及生长因子对软骨细胞分泌功能及增殖的调节，是成熟个体软骨发育及维持内环境稳定的关键。根据细胞外刺激的不同，软骨细胞可被诱导，分别进行异化基质降解或同化基质形成的功能过程。? 本