PFGE包埋暨清洗步骤流程.PDF

PFGE 包埋暨清洗步驟流程 何謂PFGE? • PFGE是脈衝式電場電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)簡稱 • 主要是利用交錯轉換電場方向來迫使大片段DNA在電 泳膠中轉向移動 ，以得到更佳的分離效果 • genomic DNA frgments10,000kb(10Mb) • 如何使genomic DNA順利且有效地完成PFGE電 泳?=包埋(Embedding) 1) Embed Cells in Agarose Cellular Protein Cell Wall Whole cultured cells are embedded in agarose. This prevents shearing of the Agarose genomic DNA during the lysis and digestion steps. DNA 2) Lyse Cell walls and digest Cellular Protein The agarose “plugs” are bathed first Lysozyme in a lysozyme ( or appropriate) solution for 1hr. Then they are bathed in Proteinase K solution overnight. Proteinase K 何謂包埋? •簡言之就是利用agarose將細菌包裹住 ， 然後以化學藥物(sodium Dodecyl sulfate, SDS)或是酵素(如proteinase K)來破壞細 胞壁打破菌體 ，最後使genomic DNA完全 裸露但依然被agarose所包裹而不會分散或 分解 流程包括: 1.增菌培養 2.菌體包埋 3.菌體溶解 4.膠塊清洗保存 增菌培養: 依不同菌種營養需求來決定培養基及培養條件 Ex. Salmonella spp.=Tryptic Soy Agar ;37 ℃ Neisseria meningitidis=TSA w/5% Sheep Blood;37 ℃;5% CO2 菌體包埋 1)配製包埋用膠液: 取0.10g Low-melt agarose +10ml TE buffer加熱製成1.0%的agarose solution 置於攝氏45度水浴槽備用 2)調製包埋用菌液: 玻璃試管內置2 ml cell suspension buffer,用無菌棉花棒取菌,調整菌液濁 度至0.4-0.6 3)包埋用膠液與菌液混合: 先取400 μl 菌液置於裝有20 μl proteinase K solution(濃度20mg/ml )之 1.5ml微量離心管 ，加入前述已配製好的1% agarose包埋用膠 ，利用 pipetman混合均勻, 但不可大力抽吸 以免破壞DNA及產生氣泡 4)鑄模成形: 將混合好之溶液以pipetman取出注入模具(pl