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不同限制性核酸内切酶对质粒 DNA的切割 —— PvuⅡ和 HindⅢ对 pUC19-P35S:ARF8双酶切 费欢 1014100060 广州大学生命科学学院生物科学 2010 级 摘要 为加深对限制性内切核酸酶切割质粒 DNA的位点特异性和其专一性的认识，采用 Pvu Ⅱ和 Hind Ⅲ两种酶双酶切质粒 DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒 DNA具有不同的 切割结果。 采用限制性内切酶 Pvu Ⅱ和 Hind Ⅲ共同对 pUC19-P35S:ARF8进行切割， 再用琼脂 糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。 结果获得 6 条带，大小分 别为 2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp 。 关键词 限制性核酸内切酶 PvuⅡ和 Hind Ⅲ、质粒 DNA、双酶切、琼脂糖凝胶电泳 引言： 限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的 DNA 切断，即能够限制异源 DNA 的 侵入并使之失去活力， 但对自己的 DNA 却无损害作用， 这样可以保护细胞原有的遗传信息。 它不同于一般的脱氧核糖核酸酶 （DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格， 要求专一 的核苷酸序列。 限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类， 即所谓Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型酶。 [1] 其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗 ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进 行修饰，但特异性弱，切割位点不固定 ; Ⅱ型水解核酸不需要消耗 ATP，它只特异性切割核 酸并不修饰碱基， 其特异性强， 切割位点固定。 [2] 限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。 本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒 DNA 的位点特异性的认识，通过实践充分了解 PvuⅡ和 Hind Ⅲ两种酶双酶切质粒 DNA产生的片段。 研究人员通过使用 15 种限制性内切酶酶切重组质粒 pBKrsv-MLCK，探讨了限制性内切 酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法。 [3] 近几年，各种动物体内线粒体 DNA的酶 切分析的研究十分广泛， 并取得了一定的成果 ( 宋平 , 李小迎 , 熊全沫 ,1994[4] ；戴建华 , 殷文 莉， 2004 [5] ；关海红 , 石连玉 , 刘明华等， 2000 [6]) ，采用 Tru 9 Ⅰ/EcoR Ⅰ和 Taq Ⅰ/Pst Ⅰ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究同样有所帮助 （王荻, 徐革锋 , 刘洋等， 2009）[7] 。没有限制性核酸内切酶的发现和应用， 就没有分子生物学的兴旺发展， 在基因工程和分子生物学中， 限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。 因此研究限制性核酸 内切酶对质粒 DNA的切割具有重要的意义。 1. 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料 重组质粒 pUC19-P35S:ARF8 由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建； 限制性内切酶： EcoRI 购自 TaKaRa等生物工程公司 ； 琼脂糖：进口分装。 1.1.2 实验设备 水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，