植物病害组织切片染色观察-国立中兴大学.PDF

第5章 植物病害組織切片染色觀察 一、前言： 用光學顯微鏡或穿透式電子顯微鏡觀察的樣品必須是透明的薄片，因此， 要先把觀察的材料製成透明的切片後，才能在顯微鏡下觀察病原菌與寄主植物 的關係，有時影像色彩對比不佳，標本須染色才能清除辨識病原菌與寄主細胞 之關係。 二、參考文獻： 1. 林金和. 2006. 生物切片技術. 國立中興大學生命科學系生物切片技術實 習教材. 131頁. 2. Baudoin, A. B. A. M., Hooper, G, R., Mathre, D. E. and Carroll, R. B. 1988. Laboratory exercises in plant pathology: an instructional kit. APS press, USA. 三、植物病害組織切片觀察： 欲觀察病原細菌與寄主植物（特別是組織細胞）之關係，須藉由光學顯微 鏡的放大及解析來觀察，但上述顯微觀察需要標本透光，故需標本切片。膠帶 法、徒手切片法及冷凍切片法將新鮮材料稍作處理後，即可進行切片，但標本 切片於玻片封片後（置於載玻片於蓋玻片之間，並以膠封住），然而玻片標本 無法長久保存（因微生物及植物本身之酵素使之崩解），若欲獲得品質更好且 可長期保存的切片，則標本需固定、脫水、包埋及切片、封片。 固定：以化學藥劑將細胞殺死，並使細胞形狀固定，一般可用FAA固定（乙醇 Ethanol+冰醋酸Glacial acetic acid+福馬林Formaldehyde ）。 脫水：通常使用TBA脫水劑（蒸餾水Distilled water+ 乙醇Ethanol+三級丁醇 tert-butyl alcohol ）將組織細胞內的水份置換、透化，以免一段時日後，微 生物及植物本身之酵素使標本組織細胞崩解 ，並須與爾後所使用包埋劑親 和。先用50%浸漬數小時後，更換數次濃度逐漸提高之TBA ，直到100% tert-butyl alcohol將組織細胞內水份完全取代（必要時可以染劑染色）。 包埋：一般以石臘或塑膠（樹脂）材料藉與脫水劑親和性高的特性，以液體形 式滲入細胞內，再以物理變化（降溫—如石臘切片）或化學變化（化學反 應使之硬化—如塑膠切片）使組織細胞內外充滿包埋劑，而整個標本塊包 埋於固化硬化的材質中。 切片：徒手切片（最薄 16μm為適）、冷凍切片（視切片機而定，一般5-10μm ）、 石臘切片（最薄5μm為適）及塑膠切片（一般可切薄1 μm以下，若超薄切 片機佳，可低於0.1 μm ）。 封片：塗上黏膠（如加拿大膠）載於玻片上，將標本切片黏著於上，加上染劑 或否，蓋上蓋玻片後，蓋玻片邊緣可以膠體（簡單者如指甲油）封住避免 液體蒸發而切片乾燥。 病害組織與病原觀察標本準備方法： （一）膠帶法：為最簡便的植物病組織表面病原菌的觀察，主要以黏性膠帶黏 住表面微細物體（包括孢子及孢子梗），於顯微鏡下觀察，一般僅能觀察 到病原菌，而病原菌與寄主的相對關係不易觀察得到。 圖5-1. 以膠帶法黏附病原以供顯微鏡觀察。 （二）徒手切片法：徒手切片是利用剃刀或刮鬍刀，用手握住材料進行切片； 或可將材料夾於通草，與通草一併切片。之後，它也包含藉著一台滑走式 的切片機進行新鮮材料切片。徒手切片優點是簡單方便，但缺點是品質不 佳，例如切片材料的厚度通常是不均勻的，當切片的厚度在25μm或更厚 時時，它的情況會好些，一般低於16 μm則不佳，除非材料經包埋。理想 的徒手切片其材料必須先完全的固定 ，而不是軟嫩之細胞或軟硬混合組成 的細胞組織，最困難的間題是如何將一片材料緊緊地夾住才能夠預防它變 2 形。一般截面的大小以不超過3-5 mm 為宜，長度2-3 cm ，較便於手持並 進行切片。