植物组织RNA提取的要点与技巧从植物组织中提取RNA-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.14.7.26 植物组织 RNA 提取的要点与技巧 从植物组织中提取 RNA 是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进 行 Northern 杂交分析，纯化mRNA 以用于体外翻译或建立cDNA 文库，RTPCR 及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA 。因此，从植物组织中提 取纯度高、完整性好的RNA 是顺利进行上述研究的关键所在。 从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的 RNA ，而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中， 或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或 RNase 的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组 织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA 相互作用。酚类化合物被氧化后 会与 RNA 不可逆地结合，导致RNA 活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA 的 丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA 共沉淀下来； 萜类化合物和 RNase 会分别造成 RNA 的化学降解和酶解。对于这些植物材料， 用常规的 RNA 提取方法 （如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以 提取出其 RNA 。如LбpezGбmez 等在用常规的方法提取芒果果实的 RNA 时未 能成功，他们的结果分为三种情况：提出的RNA 已被降解；RNA 的得率很低； 得到的 RNA 不能进行体外翻译。他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其 中也包含RNase ，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的 成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰 RNA 提取的因素。Tesniere 等 在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的 RNA 时，发现RNA 与某种未知化合物凝聚 成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在 230nm 和 270nm 处有强的光吸收， 从而干扰了 RNA 紫外吸收的测定。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、 RNase 和干扰 RNA 提取的其它代谢产物是提取高质量植物 RNA 成败的关键。 本文根据文献综述了解决上述植物 RNA 提取过程中难点的相应对策。 １ 防止酚类化合物的干扰 许多植物组织特别是植物的果实 （如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类 植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩 的植物材料中更容易提取RNA 。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落 中国试剂网 3.17.7.26 叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使 匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应 （browningeffect ）。被氧化的酚类化合物 （如醌类）能与 RNA 稳定地结合，从 而影响 RNA 的分离纯化。但Newbury 等发现 RNA 提取的难易程度与材料中酚 类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA 的 提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质 （如原花色素类 物质）是影响RNA 提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提 取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA 分开。 1.1 防止酚类化合物被氧化 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(巯基乙醇、二硫苏糖醇 （DTT ）或半 胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(巯基乙醇的浓度可高达 2% 。( 巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su 等认为在过夜沉淀 RNA 时加入(巯基乙醇 （终浓度1%）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。 硼氢化钠 （NaBH4 ）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可 被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮 （PVP ）和聚乙烯聚吡咯烷酮 （PVPP ） 中的 CO －N ＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物 中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而 可以与 PVP 或不溶性的 PVPP 形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为 多酚氧化酶的底物而