H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

， ， （ ）： ２０１６ ３７ １２ ７１２ Ｐｒｏ ｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇ ｙ Ｈ９ 亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重ＲＴ-ＰＣＲ 检测方法的建立 * 谢志勤，谢芝勋 ，范 晴，邓显文，谢丽基，罗思思，黄 莉，黄娇玲， 张艳芳，王 盛，张民秀，奉 彬，刘加波，庞耀珊 （广西壮族自治区兽医研究所，广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室，广西南宁 ５３０００１） 摘 要：根据 Ｇｅ 中 亚型禽流感病毒 基因和禽肺病毒 基因的保守序列，通过 进行 ｎＢａｎｋ Ｈ９ ＨＡ Ｆ Ｂlａｓｔ 比对，在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物，引物扩增的片段大小分别为５６９ｂｐ和４２４ ｂｐ，应用这两对引物建立了 Ｈ９ 亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重 ＲＴＰＣＲ检测方法，对建立的方法进行 了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析，以验证本方法的准 确性。特异性试验结果表明，所有参试的 Ｈ９ 亚型禽流感病毒都能扩增出大小为 ５６９ｂｐ 的片段，参试的禽 肺病毒毒株扩增出４２４ｂｐ 的片段，没有其他条带出现，而对照的参试毒株在５６９ｂｐ和４２４ｂｐ处没有任何条 带；敏感性试验结果表明，本试验建立的方法能检测到 １０ ｐｇ 的Ｈ９ 亚型禽流感病毒和禽肺病毒ＲＮＡ模板。 应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品 份进行检测， 亚型禽流感病毒阳性的样品有 份，禽 １３２ Ｈ９ ６ 肺病毒阳性的样品 份；随机各挑取 份 亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性 产物进行克隆和序列分 ２ ２ Ｈ９ ＰＣＲ 析，经比对分析，份 亚型禽流感病毒阳性 产物与 亚型禽流感病毒（ ） 同 ２ Ｈ９ ＰＣＲ Ｈ９ Ｎｏ．ＪＦ７１５０４５．１ １００％ 源，份禽肺病毒阳性 产物与禽肺病毒株（ ） 同源。本试验建立的 亚型禽流感 ２ ＰＣＲ Ｎｏ．ＡＦ１８７１５４ １００％ Ｈ９ 病毒和禽肺病毒二重 ＲＴＰＣＲ检测方法具有特异、敏感、快速的特点，可以用于临床快速准确检测 Ｈ９ 亚型 禽流感病毒和禽肺病毒。 关键词： 亚型禽流感病毒；禽肺病毒；二重反转录聚合酶链反应；检测 Ｈ９ 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： （ ） Ｓ８５２．６５９．５ Ａ １００７-５０３８ ２０１６ １２-０００７-０６ Ｈ９ 亚型禽流感病毒（ 以引起禽上呼吸道的症状。禽肺病毒除了引起禽出 ＡｖｉａｎｉｎｆlｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＨ９ ， ）和禽肺病毒（ 现喷嚏、眼结膜潮红和泪腺肿胀外，其明显的特征是 ｓｕｂｔ ｅ ＡＩＶ Ｈ９ Ａｖｉａｎ ｎｅｕｍｏｖｉｒ ｙｐ ｐ ， ）是危害养鸡业的两种重要病毒， 亚型 后期出现头部皮下肿大，有些伴随有神经症状［］８ 。 ｕｓ ＡＰＶ