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酶的分离纯化技术及进展 摘要：随着工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等在分离纯化酶的应用 关键词： 一.引言 酶作为生物催化剂，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等催化特点,在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领域有着广泛的应用[1]。 大多数工业用酶都由微生物发酵得到，且随着发酵技术的优化已能成功进行大规模生产。随着蛋白类临床治疗药物和工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题。 酶的分离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开而获得与使用目的要求相一致的有一定纯度的酶产品的过程。常规的微生物酶分离纯化方法有沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等，新兴的分离技术，如反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等在分离纯化酶的应用上也取得了一定进展。此外，利用常规方法和新颖方法相结合的分离技术为分离纯化酶提供了新的方法。 二.分离纯化酶的常规方法 纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的位置和次序，为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及分离次序的选择也至关重要。一般的分离次序遵循以下原则：将含量较多的杂质用尽量简单且经济的方法先分离出去，如沉淀、过滤和吸附；将费时又昂贵的工艺放在最后阶段。因此在分离纯化酶之前通常需要对发酵液进行预处理，对于胞外酶，发酵液经离心或过滤除掉细胞,上清液用超滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂抽提等方法浓缩；胞内酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用硫酸铵沉淀的浓缩方法。 进一步分离纯化酶的常规方法有凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱和亲和色谱，它们的技术特点及用途如表1[2]所示。离子交换、疏水性相互作用色谱和亲和色谱通常可起到蛋白质的浓缩效应，而凝胶过滤常常使样品稀释。凝胶过滤和离子交换属于常规分离方法，在此不再赘述；疏水性相互作用色谱和亲和色谱属于生物分离色谱，分别利用蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别和耦联亲和配基与吸附目标产物之间的亲和作用进行蛋白质类生物大分子分离纯化的生物色谱。亲和色谱是蛋白质检测中最专一的分离技术，环肽抗生素通常被认为是蛋白酶的一种亲和配体[3]，能高效分离酶、抗体、激素等生物物质，Linda等[4]利用亲和色谱蛋白质捕获技术分离了凝血酶。 表1 常用分离纯化酶的方法 Table 1 The common methods of separation in purifying enzyme 分离 方法 分离原理 特点 用途 凝胶 过滤 分子大小 分辨率适中，分级分离时流速较慢，脱盐时流速快，但容量受样品体积限制 适用于纯化的后期阶段，脱盐可用于任何阶段，特别是步骤衔接时的缓冲液更换 离子 交换 电 荷 分辨率较高，视支持物不同流速可很快，容量大，不受样品体积限制 最适用于大体积样品且蛋白纯度较低的样品早期纯化，可分批操作 疏水相互作用色谱 疏水极性 分辨率较高，流速快，容量大，不受样品体积限制 适用于纯化的任何阶段，特别适用于离子强度较高的样品，如沉淀、离子交换后的样品 亲和 色谱 亲和 作用 分辨率极高，流速快，容量视配体可大可小，不受样品体积限制 适用于纯化的任何阶段，特别是样品浓度小、杂质含量多时，可以减少纯化步骤 三.分离纯化酶的新兴技术 常规的纯化方法耗时、得率低，因此诸如反胶团萃取、膜技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等一些新的分离纯化技术越来越受到学者们的重视。 1 反胶团萃取技术 当有机溶剂中加入的表面活性剂浓度超过其临界值时，表面活性剂会在有机溶剂中形成由极性头聚集朝内形成内表面，非极性尾伸向外围有机溶剂形成外表面，从而形成大小为毫米级的稳定聚合体，即反胶团。该反胶团的内腔含有水分，在适宜的pH环境下，蛋白质与反胶团极性头呈相反的电荷，这种静电引力能使蛋白质从水相迁移到有机溶剂的反胶团内，从而溶解诸如蛋白质、核酸等极性物质，实现对蛋白质的有机溶剂萃取。 β-半乳糖苷酶是一种分子量大、亲水性好的球状酶，可以催化水解牛奶中的乳糖类碳水化合物，在食品应用中具有重要商业意义。由于乳糖的水解液可以用于日常产品和不耐乳糖的人群，β-半乳糖苷酶也能使乳糖转化为其他更具有商业价值的糖，因此需要获得高效且易操作的生物分离方法从其他蛋白质中分离纯化初β-半乳糖苷酶。在液化β-半乳糖苷酶时需要考虑缓冲液的类型、pH、蛋白质浓度，又由于当缓冲液浓度在40 mmol以上时β-半乳糖苷酶能被大量排斥在微乳剂小液滴外