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实验　血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离 什么是层析？ 层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），于1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来。 他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatography）。 为何需要固定相和流动相？ 任何层析都有两相：固定相(stationary phase)与流动相(mobile phase)，两相互不相溶。 固定相：是层析的基质。 可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液） 这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。对层析的效果起着关键的作用。 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 层析为何能把混合物分开？ 在层析过程中，固定相位置固定不变，并阻止所分离的组分向前移动；流动相相当于固定相作单相运动，并带动所分离的组分向前移动。 由于混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)，各组分受到的推力和阻力不同，移动速度不同，使混合物中的组分得以分离。 层析的特点 1、具有极高的分辨效力：能分离同系物、同分异构体。 2、具有极高的分析效率：只需几十分钟，乃至几分钟就可完成一个分析周期。 3、具有极高的灵敏度：样品组分含量仅数微克，或不足一个微克都可进行很好的分析。 4、操作简便，应用广泛。 在现代生化制备技术中层析法占有核心地位。 凝胶层析根据什么来分离混合物？ 混合物中各种成分因分子大小不同而被分离的技术 分子筛效应 大分子物质因其分子直径大于凝胶网孔而不能进入凝胶颗粒内部，流程短而移动速度快，先流出层析柱； 小分子组份则由其分子直径小于网状结构的孔径而进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢，后流出层析柱， 凝胶层析介质 交联葡聚糖，商品名为Sephadex，它是由葡聚糖交联而成的多孔性网状结构的凝胶颗粒 交联琼脂糖凝胶，如Sepharose-6B。 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶，商品名Sephacryl。 凝胶层析的特点及其应用 特点 操作条件温和，不会引起生物大分子的变性失活 一次装柱后凝胶可反复使用，每次洗脱过程即是凝胶的再生过程 具有高度的重复性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析 应用 脱盐；高分子溶液的浓缩 ；蛋白质分子量的测定；生物大分子的分离提纯 缺点 样品浓度会发生数倍稀释；上样量较小，仅占柱床体积2-5%。 柱层析的主要操作步骤 介质的选择与处理 装柱 柱子装的质量好坏，是能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。 一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。 平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。 平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。 柱层析的主要操作步骤（续） 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。一般说来，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量体积应低于5%的床体积。 洗脱 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。 流速太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。 流速太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。 收集、鉴定及保存 一般采用部分收集器收集分离纯化的样品。每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。 再生 许多基质可反复使用多次，且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。 实验目的 1、掌握凝胶层析原理 2、熟悉凝胶层析柱的装柱、检查、上样、洗脱与收集过程 试剂 1、葡聚糖凝胶：SephadexG-25 2、血红蛋白及核黄素 3、洗脱液：0.05M pH7.3磷酸缓冲液 注：Sephadex由于含有羟基基团，呈弱酸性，使它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 4、层析系统：层析柱（1×30cm），恒压高位槽，自动部分收集器 5、分光光度计 血红蛋白（Hemoglobin) 核黄素（Riboflavin or Vitamin B2 ) 实验操作 1、凝胶处理：溶胀与浮选 2、装柱 3、平衡：控制流速为1ml/分 4、加样与洗脱： 加样0.5ml 用少量洗脱液清洗管内壁1-2次 然后将洗脱液在柱内约加至2cm高，接上高位槽并调好流速开始洗脱 5、收