高产胞外蛋白酶正文.docVIP

高产胞外蛋白酶菌株的选育 生命科学学院 生物科学0901班 王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选 ；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1.2.1 筛选培养基： 酪素培养基 干酪素 酵母膏 甘油 dH2O K2HPO4 琼脂 pH 1g 0.25g 1.25g 250mL 0.125g 4g 8.0 1.1.2.2营养培养基： 肉汤培养基 蛋白胨 牛肉膏 NaCl H2O pH 10g 3g 5g 1000mL 7.4 1.1.2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 蛋白胨 NaCl 牛肉膏 可溶性淀粉 dH2O 琼脂 10g 5g 5g 2g 1000mL 16g （2）明胶培养基 蛋白胨 牛肉膏 明胶 dH2O pH 5g 13g 120g 1000mL 7.2—7.4 （3）葡萄糖发酵培养基 蛋白胨 NaCl K2HPO4 dH2O 1.6%溴甲酚紫 pH 10g 5g 0.2g 1000mL 1—2mL 7.2—7.4 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 蛋白胨 葡萄糖 K2PO4 dH2O pH 5g 5g 2g 1000mL 7.2—7.4 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变 取培养皿中溶液1mL，作为对照组，不做任何处理。其他分别在紫外光下照射30 ,130 和2。照射后分别取1mL按以下方法进行梯度稀释（注意此操作要在黑暗处进行）： 0： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8 3： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 1： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 130： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 2： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10