川牛膝HPLC指纹图谱探究.docVIP

川牛膝HPLC指纹图谱探究摘 要：目的：采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法：采用Waters 2695 高效液相色谱仪，色谱柱为Symmetryreg;C18(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流动相为甲醇-水二元梯度洗脱；流速为0.9ml/min；柱温为35℃；检测波长为266nm。结果：测定基地产及市场上流通的样品共18批次，标示了11个共有峰，其指纹图谱相似度均在0.9以上，指纹图谱整体面貌基本一致。结论：该方法简便、快速、准确、重现性好，为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。 关键词：川牛膝；指纹图谱；HPLC 中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-027-03 川牛膝为苋科杯苋属植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，是著名的川产道地药材之一，具有逐瘀痛经，通利关节，利尿通淋的功效[1]。川牛膝始见唐代蔺道人的《仙授理伤续断秘方》。在功效上，目前全国的一些权威著作一致认为“怀牛膝和川牛膝的功效基本相同，但是前者偏于补肾强筋骨，而后者偏于活血化瘀” [2]。现在药理学研究表明，川牛膝不仅能活血化瘀，还有很好的调节免疫系统功能的作用。 目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面，缺乏综合评价药材品质的方法和标准，且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中，种内产生很大的变异，出现伦理较多的类型，同时由于加工、储存等方法的不同，药材质量存在较大的差异，造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱，为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。 1 试验材料、试药、试剂与仪器 1.1 试验材料、试药、试剂 川牛膝药材：经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)的干燥根，符合2005年版《中国药典》规定，见表1。 对照品：杯苋甾酮(cyasterone)由四川省中医药研究所提供。试剂：甲醇(色谱纯)，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。 1.2 仪器 Waters2996-2695型高效液相色谱仪；Waters Empower化学工作站；KQ3200型超声波清洗器(40KHZ，120W)，昆山市超声仪器公司；BP-211D型电子分析天平(Max：210g，d=0.1mg)，北京赛多利仪器系统有限公司)。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Symmetryreg;C18(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流动相：甲醇-水二元梯度洗脱，如表2；流速：0.9ml/min；柱温：35℃；检测波长：266nm；进样量：20μl；运行时间：35min。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg溶液，即得。 2.2.2 样品溶液的制备 取川牛膝药材细粉(批号7#)5g(过四号筛)，精密称定，置于100ml锥形瓶中，精密量取甲醇50ml，振摇，回流提取1h，放冷，加甲醇补足损失的重量，摇匀，水浴挥干，残渣加甲醇使溶解，定容至10ml，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[3，4，5，6]。 2.3 方法学考察 2.3.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液20μl，重复进样5次，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间，表明精密度良好。 2.3.2 重复性试验 取同一批次的川牛膝药材6份，按上述样品测定方法分别测定，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间，表明方法重现性良好。 2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h分别进样20μl，≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间，表明样品在24h内稳定。 2.4 指纹图谱相似度分析 2.4.1 共有峰的标定 根据18批次供试品测定结果所给出的峰数，对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较，川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰，经与杯苋甾酮对照品对照，并比较所有记录的色谱图，选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰，其中9号峰为杯苋甾酮。 图1 川牛膝HPLC指纹图谱 2.4.2 共有图谱模式的建立 根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，以参照物峰(S)的相对保留时间和相对峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯