化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法（征求意见稿）.PDF

化妆品用化学原料体外 3T3 中性红摄取 光毒性试验方法 （征求意见稿） 一、范围 本方法规定了3T3中性红摄取光毒性试验的范围、规范 性引用文件、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试 验步骤、结果判定标准。 本方法适用于化妆品用化学原料潜在光毒性的检测。 二、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的 条款。注明日期的引用文件，其后所有的修改单(不包括勘 误的内容)或修订版均不适用于本方法，但是，鼓励使用单 位对修订部分的引用进行研究，并提出意见。研究是否可使 用这些文件的最新版本。未注明日期的引用文件，其最新版 本适用于本方法。 经济合作与发展组织（OECD）guidelines for the testing of chemicals: 3T3 NRU phototoxicity test. NO. 432 三、术语和定义 下列术语和定义适用于本方法。 （一）光毒性 （Phototoxicity） 皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所 引发的一种皮肤毒性反应。 （二）细胞活性 （cell viability） 测量某一细胞群总活性的参数（如细胞溶酶体摄取活性 染料中性红），其数值取决于测定的终点和试验所用的设计 方案，并与细胞总数和/或细胞活力相关。 （三）相对细胞活性 （relative cell viability） 通过与溶剂（阴性）对照组的相关性来表达的细胞活性， 对照组除了未经受试化学物质处理外，整个试验过程与试验 组一样（或+Irr或-Irr）。 （四）光刺激因子 （photo irritation factor; PIF） 在无细胞毒性的UV/vis照射下，受试物分别在无光照 (-Irr)和有光照(+Irr)条件下获得两组平行有效的细胞毒性浓 度(IC50 )，通过比较IC50的值得到的因子。 （五）半数抑制浓度 （IC50） 使细胞活性下降50%的受试化学物质的浓度。 （六）平均光效应 （mean photo effect; MPE） 在无细胞毒性的UV/vis照射下，受试物分别在无光照 (一Irr)和有光照(+ Irr)条件下获得两组浓度反应曲线，通过数 学分析导出的数值。 （七）预测模型 （prediction model） 将毒性试验结果转换为预测毒性潜力的算法。在本方法 中，PIF和MPE可用于把体外3T3中性红摄取光毒性试验的 结果转换为对光毒性潜力的预测。 四、试验原理 中性红是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散的方 式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。在某些化学物质和外 界条件作用下，可引起细胞表面或溶酶体膜敏感性的改变而 导致溶酶体脆性增高等不可逆变化，从而导致细胞吸收中性 红的能力下降。通过测定3T3成纤维细胞经化学物质和紫外 线照射联合作用后细胞吸收中性红能力的变化来判断该化 学物质是否具有光毒性。 五、试验材料与试剂 （一）细胞株 Balb/c 3T3 成纤维细胞。要求：来源清晰，代数明确 （100代）。 （二）培养基 高 糖 DMEM 培 养 基 ， 小 牛 血 清 （ 10% ） ， 氨 酰 胺 （4mmol/L），抗生素（青霉素和链霉素，浓度分别为 100IU/mL）。 （三）溶剂的选择 在测定前，应首先评价受试物的溶解度，以选择最佳溶 剂体系，即受试物原液是用磷酸盐缓冲液（EBSS或PBS）、 还是用有机溶剂配制。 能溶于水且浓度达1000μg/mL的受试物可溶于预先加 温（37℃ ）灭菌的EBSS或PBS。水中溶解度有限的受试物 （1000μg /mL）可用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（ETOH） 溶解。使用DMSO或ETOH作为溶剂时，其终浓度不得超过 总体积的1％（v/v），阴性对照组和受试物组溶剂的体积比 例应相同。