凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒.docVIP

凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用) （BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本） 使用说明书 一、TUNEL制品说明 凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 本试剂盒特点 ● 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。 ● 高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ● 高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ● 快速操作：整体操作约需3小时。 ● 用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 ● 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。 ● 高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性 使用注意事项 1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2． 因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 3． 为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 6. 固定好的样本可以在℃的乙醇中放置分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。 7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 9. 二、TUNEL试剂盒组分 组 份 Cat: KGA702 20 assays Cat: KGA703 50 assays Cat: KGA704 100 assays 储存条件 Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃ Biotin-11-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃ TdT Enzyme 80μL 200μL 400μL -20℃ 50×Proteinase K 40μL 100μL 200μL -20℃ Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光 DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃ 试剂盒以外自备仪器和试剂 光学显微镜、37℃孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。 二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等。 三、操作流程概览 四、检测样本的预处理 TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。 1． 细胞样本的准备 操作注意事项： 1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 2. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 3. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 五、 标记和显色反应 操作注意事项： 1. 进行清洗时，以分钟清洗次为标准。 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去溶液后再进行下一步反应 3在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。 5. 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。 6. 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30s-10min（根据样本做适当调整），蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。 六 常见问题的原因及推荐解决方案 现象 可能原因 建议 非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色） Biotin-dUTP的非特异性结合 勿使细胞干涸 在TdT酶反应之后，再