HMME光动力学疗法作用于人类乳腺癌细胞MCF-7的实验的分析研究.pdfVIP

HlVIME光动力学疗法作用于人类乳腺癌 细胞MCF．7的实验研究 专业：生物医学工程 硕士生：于丽 指导教师：李晓原副教授 摘要 光动力学疗法(photodynamic 细胞凋亡和坏死的肿瘤治疗方法。光动力学的作用因素包括对光敏感的物质—— 光敏剂、光以及氧分子。光敏剂可以被病变靶组织选择性的吸收，在合适波长的 光的激发下，通过能量的转换产生活性氧物质，从而造成对靶组织的损伤。 如化学成分复杂、对波长大于600nm以上可见光区吸收弱以及治疗后皮肤长时间 的光敏感(长达lO周)等。因此现在研究了大量的第二代光敏剂，以应用于更广 泛的领域。血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethyl 型的卟啉类第二代光敏剂，并己在基础实验和临床试验中证明了它的高效性。但 目前尚无HMME—PDT对乳腺癌细胞作用的研究，对其杀伤肿瘤细胞作用机制的研 究也需要进一步的探讨。 光照射，研究不同光敏剂剂量及不同激光照射剂量的光动力学作用对MCF．7的影 显微镜、流式细胞仪等技术检测诱导细胞凋亡的情况。用激光扫描共聚焦显微镜 可能的作用机制。 方法： 1．细胞抑制率检测 u 每孔100l，用无血清的培养液培养24小时，使细胞周期同步化。然后加入不同 终浓度的光敏剂在37C避光孵育2小时，再用PBS洗3次，加入完全培养基，即 刻进行激光照射。照光后将培养板放置在培养箱继续避光培养24小时，然后每孔 加入10山Cell Kit Counting 每孔的吸光度。用处理组的吸光度与对照组吸光度相比来表示各组的细胞抑制率。 J／cm2(b组)、4．8J／cm2(c组)、9．6J／cm2(d组)、 行照射，1．2J／cm2(a组)、2．4 J／cm2、4．8j／cm2、9．6J／em2、19．2J／cm2) J／cm2、2．4 801．tg／m1)、单纯激光照射组(1．2 和空自对照组。每个处理组设8孔。 2．形态学观察(电镜和荧光显微镜) 为2．4J／cm2。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养24小时，分别 进行Hoechst33342染色荧光显微镜观察和固定包埋切片电镜观察。 3．流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率 使细胞周期同步化。PDT处理步骤同形态学观察。光动力学作用后，再培养24小 时，收集各组细胞，上流式细胞仪检测细胞的凋亡率和坏死率。 4．激光共聚焦显微镜检测 将细胞接种于35mmPetri培养皿。细胞贴壁后，根据实验需要分别用HMME KRH维持 和不同的荧光探针进行孵育，然后用KRH缓冲液冲洗3次，加入lml 细胞的生理状态。置于共聚焦显微镜下进行观察。 实验结果： 1．单纯激光组照射组的吸光度与空白对照组比较，无统计学差异，即单纯激光 II 照射对MCF．7的增殖无明显抑制作用。单纯光敏剂组的吸光度与空白对照组比较， 的吸光度与空白对照组比较，有统计学差异，即当激光和光敏剂同时存在时，对 MCF．7有生长抑制作用。 PDT对MCF．7的抑制程度与光敏剂浓度和激光照射剂量在一定范围内呈正比 J／cIn2以上时，细胞 关系。当光敏剂浓度升至40“g／ml、激光照射能量密度增至4．8 抑制率不再随着剂量的增加而增加，组间进行比较无统计学意义。当光敏剂浓度 增至801．tg／ml时，细胞抑制率随激光照射能量密度增加而增长的趋势变缓，相邻组 间差异无统计学意义，当激光照射能量密度增至4．8J／cm2以上时，组问差异无统 计学意义。 细胞发生凋亡和坏死。 3．通过共聚焦显微镜检测，观察到HMME的荧光与线粒体的荧光有重叠。PD