基于固定化酶的乙酰胆碱酯酶抑制剂体外筛选模型的建立.pdfVIP

V01．34 高等学校化学学报 No．5 CHEMICALOFCHINESEUNIVERSI，I’IES 112l。1126 2013年5月 JOURNAL 基于固定化酶的乙酰胆碱酯酶抑制剂 体外筛选模型的建立 陈 晨1”，史 倩1，陈军辉1，张茹潭1，李鑫1，郑 立1，王小如13 (1．国家海洋局第一海洋研究所现代分析技术及中药标准化重点实验室，青岛266061； 2．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；3．厦门大学化学化工学院，厦门361005) 摘要以可重复使用的固定化酶代替游离态酶，建立一种基于比色分析的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂体外 筛选新模型．采用以氨基化硅胶为载体固定的AChE优化了实验条件，用AChE抑制剂阳性对照物他克林和 毒扁豆碱对该模型进行验证，还对模型技术参数进行评价，并将新模型用于单体化合物及天然产物粗提物 AChE抑制活性评价．结果表明，最佳实验条件为：固定化酶用量55恤L，底物浓度5mmol／L，甲醇、乙醇及 体积分数不高于6％的二甲基亚砜水溶液均可作为样品溶剂；模型验证及模型技术参数评价结果良好，该模 型对AChE抑制剂筛选有较好的特异性和灵敏度，可用于筛选AChE抑制剂．该模型具有适用性强、固定化 酶可重复使用及结果可靠等优点，是单体化合物及天然产物粗提物AChE抑制剂活性评价的有效方法． 关键词 固定化酶；乙酰胆碱酯酶抑制剂；靶酶抑制剂筛选 中图分类号0652．1 文献标志码A 近年来，利用乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂能阻止突触间隙内乙酰胆碱神经传递的降解，从而提 高胆碱能神经递质的性质，是设计治疗阿兹海默病(AD)用药的主要机理之一¨J．AChE抑制剂已经成 为临床上治疗AD的重要药物，但目前临床上使用的AChE抑制剂普遍存在不同程度的副作用，如肝 脏毒性、胃肠功能紊乱和口服生物利用度低等‘2J．现有的几个高效的AChE抑制剂，如石杉碱甲和加 兰他敏均源于天然药用植物，表明天然药物仍是AChE抑制剂的重要来源之一日o．若从天然药物中发 的主要方法是基于比色分析的Ellman’S法及相关的改进方法。4曲J，这些方法简便、对仪器设备要求 低、应用广泛．此外，还有薄层显色法1、微孔板检测法旧J、荧光显色法一1和电喷雾质谱法(ESI． Ms)¨叫等，但这些方法均需要使用大量的AChE溶液，由于游离态酶不能重复利用导致成本升高，且 对样品溶剂的要求较为苛刻．与游离态酶相比，固定化酶具有稳定性好、可重复利用且产物容易从反 应媒介中分离…一引等优点；迄今，已有大量关于固定化AChE的研究报道，主要是将固定化AChE传 感器用于有机磷农药及杀虫剂等的检测¨4，15J．而在AChE抑制剂体外筛选方面，主要是研制固定化 AChE反应器，结合毛细管电泳和质谱等检测方法用于AChE抑制剂体外的筛选¨¨18J．采用固定化 别采用电喷雾质谱和基质辅助激光解离飞行时间质谱作为检测方法，建立了相关的模型；但质谱仪价 格昂贵，因此该方法难以普及和推广．在前文拉叫的基础上，本文建立了基于比色法固定化酶体外筛选 AChE抑制剂新模型，为天然产物中AChE抑制剂的快速发现提供了新方法． 1 实验部分 1．1试剂与仪器 643，200—425目，15nm)、电鳗乙酰胆碱酯酶、碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)、 硅胶(Davisil，grade 收稿13期：2012-08-21． 基金项目：国家自然科学基金(批准号和国家“八六三”计划项目(批准号：2007AA092001．10)资助 联系人简介：陈军辉，男，博士，副研究员，主要从事天然产物化学方面的研究．E·mail：jhchen@rio．org．cn 高等学校化学学报 y一氨丙基三甲氧基硅烷(APS)购于美国AlfaAesar公司；盐酸(优级纯)购于上海振兴化工三厂；戊二 醛、丙酮和甲苯等均为分析纯，购于烟台三合化学试剂有限公司；实验用水为自制Milli．Q超纯水；柄 海鞘、海胆、浒苔、石莼、黄连和黄柏等均购于青岛沿海或青岛各大药店． Tecaninfinite