山东省济宁市学而优教育咨询有限公司高考生物一轮复习-第11单元-第43课时-生物技术在组织培养、DNA和蛋白质分离及有效成分提取中的应用3.13课件-新人教版.pptVIP

排雷　 PCR扩增技术和DNA复制的比较 短时间内形成大量目的基因DNA片段，呈指数增长——2n 形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次 特点 四种脱氧核苷酸 四种脱氧核苷酸 原料 模板、ATP、引物链(DNA及RNA片段)、温度变化(90～95℃→55～60℃→70～75℃) 模板、ATP、引物链(RNA)、常温 条件 耐热的DNA聚合酶(Taq酶) DNA聚合酶、解旋酶 酶 碱基互补配对 碱基互补配对 原理 生物体外 细胞核内 场所 PCR扩增技术 DNA复制 考点137　 生物科技实践应用——血红蛋白的提取和分离 1．蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。 2．凝胶色谱原理 (1)识图析图 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 图A，相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 图B，①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 后流出 先流出 洗脱次序 较长 较短 经过路程 垂直向下和无规则扩散运动 垂直向下 运动方式 能进入 不能进入 凝胶内部 相对分子质量小 相对分子质量大 蛋白质 比较　　 (2)列表比较  提醒　凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大；凝胶色谱柱的高度与分离度有关。 3．凝胶电泳法原理 凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速率不同。如下表： √ √ 分子大小 √ √ 分子形状 √ √ 电荷量 √ 电荷性质 决定运动速率 形成阻力 形成库仑力 决定运动方向 4.实验操作流程  样品的处理  粗分离——透析(去除小分子杂质)　  纯化——凝胶色谱法进行分离和纯化　 纯度鉴定——SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 提醒　①红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果。 ②血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是使红细胞吸水涨破，甲苯的作用主要是溶解细胞膜。 ③为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1～2 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。 ④滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防止破坏凝胶面。 4．(2011·广东卷，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是 (　　) A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢 对位训练 答案　D 解析 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速率较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。 排雷　(1)血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速率过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 (2)凝胶的装填标准是紧密、均匀。检测凝胶色谱柱的装填是否成功可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是