新农抗702对水稻纹枯病菌细胞膜的影响.docVIP

新农抗702对水稻纹枯病菌细胞膜的影响 本研究所使用的新农抗702可使水稻纹枯病菌出现塌陷现象，干瘪褶皱；细胞内含物外渗现象、细胞出现空腔等，表明该活性物质的作用位点可能在细胞壁或细胞膜上。分别采用生化测定等手段测定了水稻纹枯病菌经新农抗702作用后K+和Ca2+含量的变化、ATP酶活性、丙二醛、过氧化氢酶活性等指标，初步确定新农抗702的作用位点，为进一步研究新农抗702的作用机理提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)江西农业大学。 1.1. 新农抗702 (Antifungalmycin 702)(纯度99.46%由江西农业大学生物应用微生物实验室提供，精密称取，用甲醇溶解配成μg/mL的母液。 其它试剂均为分析纯或按国家标准GB)规定要求 1.1.3培养基 PDA培养基 1.1.4 溶液的配制 钙离子储备液的配制（1 mg/mL）：称取2.497 g CaCO3放入烧杯中，加入50 mL盐酸（6.0 M）定容。 钙离子标准溶液（100 μg/mL）：取25 mL储液加入250 mL容量瓶中，用盐酸（0.6 M）定容，配制的标准液储液贮存在聚乙烯瓶中，可以再一周内使用。 钾离子标准贮备溶液（含钾1.000 g/L）：称取(1.9067±0.0003) g基准氯化钾(KCl)。以水溶解并移至1000 mL容量瓶中，稀释至标线.摇匀。将此溶液及时转入聚乙烯瓶中保存。 钾离子标准溶液（含钾100.00 mg/L）：吸取钾标准贮备溶液10.00 mL于100 mL容量瓶中，加入5 mL的硝酸镧溶液、5 mL的氯化铯溶液和5 mL盐酸（6.0 M）。 1.1.5主要试剂 麦角固醇标准品（阿拉丁试剂，纯度98%）；色谱甲醇；超微量 ATP 酶测试盒（南京建成）；无水乙醇，盐酸等均为国产分析纯。 1.1.6主要仪器 SPD-10A高效液相岛津 3200原子吸收分光光度计 UV765紫外分光光度计（上海精密科学仪器） DDS-307A 型 1.2 试验方法 将培养2d的供试水稻纹枯病菌接种于PD培养液中，， 新农抗702对水稻纹枯病 菌体的前处理：用直径为10 mm的打孔器打取水稻纹枯病菌菌块（培养时间为2 d），接入300 mL PD培养液中，25 ℃ 180 rad/min摇瓶培养2 d。4000 rpm离心获得菌丝体，用去离子水冲洗2～3次，精确称取0.2 g于10 mL的离心管中，依次加入10 mL 6 μg/mL的新农抗702溶液，对照加入等量的超纯水，分别在作用0、30、90、210、300、500 min时取样。放入瓷坩埚中，先在低温电炉上碳化2h，将瓷坩埚转入马福炉，升温至200 ℃继续碳化30 min。然后采用每30 min温度升高100 ℃，升温至600 ℃，直至灰化完全得白色灰粉[]。待冷却至室温后，向坩埚内加入10 mL盐酸（6.0 M），放置低温电路上消～化提取，直至盐酸体积减少到0.5 mL。冷却后用盐酸（0.6 M）将柑锅内样品无损转入100 mL容量瓶内，加入5 mL的硝酸镧溶液、5 mL的氯化铯溶液并定容至刻度。 钙离子校正曲线制备：用水稀释钙离子标准溶液，每100 mL中加入5 mL的硝酸镧溶液、5 mL的氯化铯溶液和5 mL盐酸（6.0 M）。配制一组浓度适宜的校正溶液。测定镧/铯空白液的OD值。测定校正溶液吸光度，并减去镧/铯空白液的OD值，绘制标准曲线。工作波长： 422.7 nm Y=0.0250X+0.0009 R2=0.9997 钾离子校正曲线制备：与钙离子校正曲线制备相同，工作波长：766.5 nm。 Y = 0.0261X+ 0.0341 R2 = 0.9905 水稻纹枯病 新农抗702对水稻纹枯病 菌体前处理：取对数生长期的新鲜菌丝体，经蒸馏水冲洗数次、抽滤。各取鲜菌丝2.0 g于50 mL的离心管中，依次加入20 mL 6 μg/mL的新农抗702溶液，对照加入等量的超纯水，分别在作用0、30、90、210、300min时取样。 ⑴ 丙二醛测定 0.67% 2-硫代巴比妥酸(TBA)：称取0.335g 2-硫代巴比妥酸用少量1.0 mol/L Na0H溶液溶解，再用10%的三氯乙酸定容至50mL。 参考王春梅等的方法，称取g菌丝，加入mL10%的三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，冰浴下研磨至匀浆， 4℃、10000离心10min，上清液即为样品提取液。吸取上清液2mL加2 mL10TCA)，加入2 mL 0.67%TBA溶液，混匀沸水浴15 min，冰浴冷却终止反应， 4 ℃、10000离心10 min，取上清液测定532 nm、600 nm和450 nm波长下的吸光度TBA体积比5:2的比例测定。