巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立.pdfVIP

中国畜牧兽医 2013年第40卷第9期 生物技术 ·23· 巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立 郭捷1．谢芝勋2，罗思思2。刘加波2。邓显文2，谢志勤2，庞耀珊2，范睛2 (1．广西大学，动物科学技术学院，广西南宁530004；2．广西壮族自治区兽医研究所， 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001) influenza 摘要：为建立快速、准确检测HI亚型禽流感病毒(avian 方法能特异性检测到H1亚型AIV，其敏感性最低能检测到13．2 RNA模板。本研究建立的巢式PCR fg／／-L的H1亚型AIV 方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。 关键词：H1亚型禽流感病毒；巢式PCR；检测 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1671—7236(2013)09—0023—04 禽流感(avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科多方面得到了广泛应用(谢芝勋等，2002；杨素等， influenza A型流感病毒属的A型流感病毒(avian virus，AIV)引起的各种家禽及野生禽类感染和／或不同的引物且2次连续放大，故可提高PCR检测的 疾病综合征(甘孟侯，1995)。AIV主要感染家禽灵敏度，保证产物的特异性，使灵敏度和特异性在理 (如鸡、鸭等)，可对感染宿主的呼吸道造成严重损 论上高于传统的PCR技术。因此，本研究通过建立 伤，使宿主表现出不同程度的临床症状，严重者可造 成家禽大面积的感染和死亡。根据AIV外膜血凝 断提供快速简便的技术，同时也增强其在PCR反应 中的特异性和敏感性。 素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个 HA亚型和9个NA亚型。作为AIV的自然宿主，1材料与方法 水禽、岸基鸟和鸥理论上可感染所能分离出的所有 1．1 AIV亚型，并由它们经粪便将病毒排出体外，造成 兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室分离鉴定； H5N2和H7N2亚型AIV 环境污染特别是水系污染，进一步将病毒传播出去， RNA均由美国康州大学 也可由南北迁徙的候鸟将病毒进一步扩散(马寅生 禽病诊断研究室惠赠；新城疫病毒(NDV)F48株、 等，2009；Webster等，1992)。 随着AIV检测技术的不断成熟和发展，结果发 现除家禽外，在一些哺乳动物体内也能检测到AIV 广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室保存。 1．2试剂 LS 的存在。H1亚型流感病毒在人和猪体内的检测发 RNA提取试剂TRlzolReagent购 现日益增多，造成的危害不容忽视。但对于H1亚 PCR 型AIV快速且敏感的检测方法在该领域研究较少。 Mix和质粒小量提 自TaKaRa公司；2×Taq 20世纪90年代之后，国内外众多学者在PCR技术取试剂盒均购自北京天根生物技术公司。 广泛应用的基础上，发展并形成了巢式PCR技术 (nested PCR，nPCR)。目前，巢式PCR技术已在许的H1亚型AIVHA基因核苷酸序列，找到较为保 Premier 守的区域，利用Primer 5．0生物软