c-Met基因siRNA慢病毒表达载体的构建和其稳定转染细胞株的筛选.pdfVIP

目 录 中文摘要…………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………．．3 研究论文c—Met基因siliNA慢病毒表达载体的构建及其 稳定转染细胞株的筛选 前言…………………………………………………………………………．5日IJ舌…………………………………………………………………………．5 材料与方法………………………………………………。6 结果………………………………………………………………………一22 附图…………………………………………………………23 附表………………………………………………………………………29 讨论………………………………………………………………………．．30 结论………………………………………………………………………．．33 参考文献…………………………………………………33 综述 酪氨酸激酶受体c-Met及其信号途径与肿瘤的 发展与治疗……………………………………………37 致谢………………………………………………………………………………．48 个人简历………………………………………………………．49 中文摘要 i c—Met基因sRNA慢病毒表达载体的构建及其 稳定转染细胞株的筛选 摘 要 在我国结直肠癌的发病率居所有恶性肿瘤第三位。主要死因为血性及 淋巴转移，约30—40％的患者在确诊时己发生转移。常见转移部位有区 域淋巴结，肝脏，肺及腹膜，其中以肝脏最为常见，因此抑制转移将 成为结直肠癌的有效治疗方法。研究发现HGF／c．Met信号通路与结直 肠癌肝转移密切相关。肝细胞生长因子HGF又称离散因子(scatterfactor， SF)，其受体为C．Met，两者结合后可激活多条下游信号通路，具有强促 有丝分裂、组织器官成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等 作用。在一些恶性肿瘤组织中包括结直肠癌在内， c．Met基因存在突变、 过表达，而且与肿瘤发生、发展、转移及患者预后有密切关系。有研究表 明，合并肝转移的结直肠癌患者中c．Met拷贝数存在以下关系：肝转移灶 正常肝组织，肝转移灶原发灶，而且HGF含量较无肝转移的患者高。 因此，HGF／c．Met极有可能成为结直肠癌，尤其是合并肝转移的结直肠 癌新的治疗靶点。 小分子干扰RNA(smallinterfering 紧密相连的非编码RNA之一，是后基因组时代的重要研究工具。其作用 silencing 与反义小干扰RNA配对序列的中部，然后靶标mRNA降解。 殖和移行，并呈质量浓度依赖性。本实验采用RNAi方法抑制HGF受体 SW620的增殖和移行的影响，以期寻找治疗结直肠癌的新方法。 目的：筛选结肠癌细胞c．Met特异性siRNA并构建其慢病毒载体； 包装病毒并筛选稳定下调c．Met的SW620细胞系。 方法： 中文摘要 列的慢病毒质粒转染入人结肠癌细胞株SW620，同时设立空白对照。 2用Western 变情况。 株。 4倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。 结果： 1通过酶切及公司测序等方法验证构建慢病毒载体的正确性，成功构建慢 1-met并将其转染入人结肠癌细胞株SW620中。 病毒载体pSD3 2采用Western Blot，RT-PCR方法检测转染pSD3 c．Met的mRNA和蛋白表达均较对照组显著降低。 的病毒基因整合到宿主细胞基因组中，WesternBlot检测c．Met蛋白表达 下降。 1-met组，细胞增 4倒置显微镜下观察发现，在转染后48小时，转染pSD3 殖明显减少，细胞数量减少，细胞聚集情况明显抑制。