Calpain活化对跨膜AMPA受体调节蛋白的影响和其作用机制研究.pdfVIP

中文摘要 第一部分体外calpain原位活化对大鼠脑组织stargazin／TRP—Y8的影响 目的：在中枢神经系统，AMPA受体介导快速兴奋性突触传导，突触膜上AMPA受体的 数量和功能直接影响突触传导的效能。TARPs作为跨膜AMPA受体调节蛋白家族，在 AMPA受体由细胞内向细胞外转运、突触膜定位及调节受体功能方面起着重要的作用。 体在突触后致密区的表达。本部分实验旨在通过原位活化calpain后，研究大鼠脑组 8 的表达情况，以明确calpain的活化是否会导致stargazin及TARP—y8免疫活性的 变化。 方法：实验采用生后4周的SD雄性大鼠(n=4)，断头取脑后直接制作冰冻切片(20 um)，给予含有氯化钙或者calpain抑制剂的缓冲液进行预处理，采用免疫组织化学 染色的方法，光镜下观察stargazin及TARP—Y8在各部分脑组织的表达情况。并且 对不同预处理后的冰冻切片进行western 及TARP—Y 8蛋白的表达情况。最后，为进一步论证实验结果，直接使用calpain活 化脑细胞膜成分，使用western 8的表 达情况。 结果：冰冻切片的免疫组织化学结果显示，经氯化钙处理后，脑组织各区域包括小脑、 示，氯化钙处理后stargazin的蛋白表达量明显降低，量化结果显示，和对照组相比， 冻切片的免疫组织化学结果显示，氯化钙处理后，TARP-Y8的免疫活性在海马各区的 椎体细胞胞体层明显增加，树突部位的免疫活性没有发生变化，和对照组相比，胞体 并没有改变TARP—Y8在海马椎体细胞胞体层的免疫活性，表达情况和对照组相仿。 在大鼠大脑皮层，不同处理组TARP—Y8的表达情况没有发生变化。冰冻切片匀浆的 western blot蛋白印迹结果显示，各组TARP—Y8的表达没有发生改变。脑组织膜成 分的western 8的 免疫表达没有发生变化。 位活化的calpain所裂解。2．TARP—Y8并不是calpain的作用底物，但是它在海马 组织的表达和分布和钙相关，提示存在另一种钙依赖的介导物质。3．calpain介导的 和功能的机制。 关键词： calpain，stargazin，AMPA受体，钙，突触可塑性 2 目的：作为兴奋性神经递质谷氨酸盐的离子型受体，AMPA受体介导中枢神经系统兴奋 毒性反应的病理生理过程。红藻氨酸诱导的惊厥发作是研究癫痫和神经兴奋毒性损伤 的经典模型，同时红藻氨酸也是体内活化calpain的方法之一。本部分实验主要研究 8在 厥及神经元兴奋毒性损伤中的作用及可能的潜在机制。 方法：实验采用4周龄SD雄性大鼠(n=16)，随机分成红藻氨酸诱导惊厥2小时组、 红藻氨酸诱导惊厥4小时组及相关对照组。惊厥组给予腹腔注射红藻氨酸(1Omg／Kg)。 根据Racine分级判断惊厥级别，惊厥发作达到第5阶段或以上者纳入实验。惊厥组 Y8在大鼠脑组织各部位的分布及表达情况、stargazin及TARP-Y8和AMPA受体GIuRI 亚单位同时表达情况。另外，为进一步证明免疫组织化学的结果，分别在惊厥发作2 小时和4小时后获取大鼠小脑、海马和大脑皮层部位的组织，通过westernblot蛋 白印迹法定量检测stargazin在脑组织不同部位的表达情况。 结果：免疫荧光的结果显示，红藻氨酸诱导惊厥发作后2小时以及4小时，在小脑浦 显下降。量化结果显示，和对照组相比，差异具有统计学意义，pO．Ol。惊厥不同时 表达水平明显下降，下降程度和stargazin相仿，和对照组相比，差异存在统计学意 义，pO．Ol。Westernblot蛋白印迹检测的结果和免疫荧光结果一致。和体外实验不 8在海马部位的表达水平降低，和对照组相比 同的是，红藻氨酸诱导惊厥后，TARP—Y 存在统计学差异，pO．Ol。TARP—Y8在大鼠大脑皮层的表达水平没有发生变化，和体 外结果一致