合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化和性质的分析研究.pdfVIP

摘要 以合浦珠母贝(Pinetada Fucata)的外套膜和内脏团为提酶材料， 经Tris—HCl缓冲液(pH8．9)抽提，正丁醇处理，硫酸铵分级分离获得粗 G-150凝胶过滤柱层析，DEAE一32离子交 酶制剂，进一步经过Sep,hadex 换柱层析等纯化，获得电泳和层析单一纯的碱性磷酸酶制剂，比活力达 8723 unJt／mg。测定酶的分子量为85．5 kD，是由两个分子量为43kD的 相同的亚基组成。 该酶对底物pNPP的水解反应的最适温度是45。c，最适pH为9．72， 活化能为20．14kJ·mol～，初速度为6．1}．Lmol·L～·min～。米氏常数 1(-为2．86 mmpl／L，最大反应速度V．为9．09 pmot／(L·min)。 f Hpo,2一是合涌珠母贝碱性磷酸酶催化pNPP水解的产物之一，wo产是产 物类似物，它们对酶均起了较强的抑制作用，其中10mmol／L的HP07使 酶活力仅余29％，而10 mmol／L的w0。’使酶活力仅余33％，它们对酶 活性的抑制类型均是竞争性抑制。正一价和正三价的金属离子对酶活力无 影响。正二价的金属离子中，Mg”、c矿、Mn。、C02+对酶有明显的激活作 用，其激活程度分别为164．7％、134％、226．2％、128．64％：而cd”、 Pb’、zn’、cu2+对酶有抑制作用，其抑制效果分别为82．3％、73．2％、23．68 ％、30．9％。其中，Mg”对酶的激活作用是非竞争型激活。Co-+对酶的激活 作用不同于孵‘的激活类型，属于竞争型激活。Mn：+对酶的激活类型不同 于M99和co”，属于混合型激活。zn：+对酶的抑制类型是典型的反竞争型抑 制。DTT对酶有明显的抑制作用，随着D11T浓度的加大，酶逐渐丧失活力。 DTT对酶的抑制类型属于非竞争型抑制。EDTA是一种金属离子鳌和剂，它 能夺走碱性磷酸酶分子内的金属离子。以EDTA为效应物，随着EDTA浓度 的增大及作用水时间的延长，酶分子内的金属离子逐渐丧失，酶活力下降， 直至完全失括。关于EBT／L对酶的抑制类型属于竞争性抑制作用。 以盐酸胍、脲及SDS为变性剂，紫外光吸收图谱表明酶分子的构象 发生了变化。6mol／L的盐酸胍能使酶活力下降到3％，而同样浓度的脲 只能使酶活力下降到28．1％。50mmol／L的SDS使酶活力仅余4．7％。 酶化学修饰的研究结果表明，酶活性中心有一个组氨酸残基、一个 色氨酸残基，而且赖氨酸的氨基、精氨酸的胍基也是酶活性中心所必需的， 但半胱氨酸的巯基则不是酶活性必需的基团。 研究盐酸胍对酶的失活动力学，发现经过盐酸胍预处理24 h的酶是 不可逆失活，整个动力学模型呈不可逆的竞争性抑制。 研究插核对合浦珠母贝外套膜上碱性磷酸酶比活力的影响，结果表、 明，开始由于创伤，该酶比活力下降，而后开始提高，可见在珍珠质形成 和分泌的过程中，该酶的比活力会有明显提高。 关于一些药剂对外套膜小片上碱性磷酸酶活力的影响的试验结果表 明，PVP、ATP、促珠泌素混合试剂能较有效提高酶活力，这对人工育珠的 产量和质量有一定的影响。 ／ 关键词：合浦珠母贝碱性磷盘螽，理化性语，功能塞囱，效应物，抑制 动力学，构象，外套膜，插核 ÷．／ 、 Ⅱ Abstract Pinetada martensiidunker alkaline phosphatase(EC3．1．3．1