PITX1基因在骨肉瘤中的表达和其调控机制的研究.pdfVIP

汕头大学医学院硕士毕业论 摘 要 骨肉瘤是高度恶性的原发骨肿瘤，多见于儿童、青少年，临床治疗难度大，治愈率低。 目前通常采取手术，放、化疗等为主的综合治疗手段，尽管应用新辅助化疗法明显提高了 患者生存率，但近30年来，骨肉瘤的治疗方面的进展较为缓慢。据统计，骨肉瘤的5年 生存率及总生存率均在60％左右，即使是运用了联合治疗手段，仍有大约40％患者最终 死于骨肉瘤的肺转移。另外，化疗毒副反应严重，耐药性的出现也使现有化疗手段陷入困 境。骨肉瘤发生、发展的分子机制至今仍然没有得到很好的阐明。因此，对骨肉瘤发生、 发展的分子机制进行深入研究，寻找特异性基因治疗靶点，将有助于我们更早、更准确的 诊断，以及开发新的、安全有效的理想治疗方案。 PITX1 （paired-likehomeodomaintrancriptionfactor1,PITX1）基因在人类多种肿瘤的 发生、发展中发挥着重要的作用，并逐步被证实为抑癌基因。PITX1作为抑癌基因参与肿 瘤调节过程是通过抑制PITX1 的表达，诱导人原始细胞的致癌信号，从而激活Ras，促使 细胞无限增殖，导致多种肿瘤的发生发展。在乳腺癌的发生发展过程中，LiuDX等人进 一步确证了PITX1作为一抑癌基因参与肿瘤的发生发展过程。并指出，PITX1是P53 的 上游转录因子，通过P53影响乳腺癌的发展。但PITX1在骨肉瘤发生发展过程中的作用 及机制国内外仍未见报道。本研究拟检测PITX1基因在骨肉瘤中的表达情况，并初步探 讨其临床意义及调控分子机制，为骨肉瘤的早期诊断及寻找新的、更为有效的治疗方法提 供理论依据。 方法： 第一部分：PITX1在骨肉瘤组织中的表达及临床意义 1. 收集骨肉瘤及正常骨组织蜡块标本，制成石蜡切片。 2. 免疫组织学分析，检测PITX1蛋白在正常骨组织及骨肉瘤组织中的表达情况。 3. 收集相应骨肉瘤患者临床信息资料，并按一定标准分组。 4. 实验数据分析和处理。用GraphPadPrism5.0软件进行统计学分析，测得数据采 ± x±s t 用均值 标准差（ ）表示，计量资料的组间比较采用单因素方差分析和 检验，率的 比较采用Chi—Square检验，生存分析采用Kaplan—Meire法与COX 比例风险模型进行 I 汕头大学医学院硕士毕业论 统计分析。 第二部分：PITX1对U2OS细胞株的影响 1. 细胞培养：骨肉瘤细胞株U2OS用DMEM/F12 1:1（含10% 胎牛血清），在37 ℃ 5%CO 饱和湿度条件下培养。 2 2. 以Lipofectamine2000为载体，将设计合成的PITX1-siRNA转染U2OS细胞株。 按转染的不同分不同实验对照组。 3.Real-TimePCR检测U2OS细胞中各处理组PITX1、RASAL1、P53mRNA 的表达 情况。 4. 蛋白免疫印迹法检测U2OS细胞中各处理组PITX1、RASAL1、P53蛋白的表达情 况。 5.MTT法检测PITX1-siRNA对U2OS细胞增殖的影响。 6. 流式细胞术检测PITX1-siRNA对U2OS细胞凋亡的影响。 7.Transwell小室法检测PITX1-siRNA 对U2OS细胞迁移、侵袭能力的影响。 8. 实验数据分析和处理。用GraphPadPrism5.0软件进行统计学分析，数据使用单因 素方差分析的Newman-Keuls检验进行统计学分析。 结果： 第一部分：PITX1在骨肉瘤组织中的表达及临床意义 1．PITX1在骨肉瘤组织的表达显著低于正常骨组织。 2．PITX1与骨肉瘤患者的生存期、肺转移密切相关。 3．PITX1高表达为骨肉瘤患者预后的有利因素。 第二部分：抑制PITX1对U2OS细胞株的影响 1．U2OS细胞中，抑制PITX1基因后，下游基因RASAL1、P53mRNA及蛋白的表 达出现相应的下调。 2．U2OS细胞中，抑制PITX1基因后，细胞的侵袭、迁移