基于gbs技术构建xxx相关案例遗传图谱.docVIP

基于GBS技术构建XXX遗传图谱 目 录 1 研究背景 3 3 GBS构建XXX遗传图谱 7 3.1 实验策略 7 3.1.1 DNA样本要求 7 3.1.2 样本的选取 7 3.1.3 建库策略 7 3.1.4 测序策略 7 3.2 技术路线 9 4 信息分析 10 4.1 数据质控 10 4.2 与参考基因组比对 11 4.3 SNP标记检测及筛选 12 4.4 亲本之间多态性分析 13 4.5 子代基因分型 13 4.6 标记筛选 13 4.7 构建遗传图谱 14 4.8遗传图谱质量评估 15 5 项目周期及指标 17 6 相关案例 18 1 研究背景 通过选取合适的限制性内切酶结合高通量群体测序构建SNP分子标记，可用于群体进化分析、高密度遗传图谱构建、QTL定位、以及辅助基因组组装连接染色体等领域。 利用传统的标记，构建的图谱精细度较低，本研究拟采用结合高通量测序技术和生物信息分析技术，对两个亲本和100个群体进行高通量测序，检测最新且最有效的分子标记SNP，构建高质量的遗传图谱，从而用于定位。构建遗传图谱 GBS技术路线 GBS 技术流程如图1所示，主要包括三个部分： 1）实验部分：电子酶切评估，根据物种、科研目的选择合适内切酶，样本检测合格后建库，于HiSeq2500测序平台上测序； 2）标准信息分析：原始测序数据经过基本质控后，与参考基因组进行比对，进行变异检测及筛选； 3）高级信息分析：包括亲本间多态性分析、子代基因分型、标记筛选、遗传图谱构建等分析。 图1 GBS 技术路线 2.2 本项目信息分析内容 信息分析内容：数据质控（去除接头和低质量数据）、GBS tag产出数据统计；与参考基因组进行比对、SNP检测、遗传图谱构建、其他定制化分析（QTL定位等）。 2.3 GBS实验策略 2.3.1 文库构建及测序 GBS文库构建，首先应用限制性内切酶对基因组进行酶切，加上带有barcode的接头后，对每个样品进行扩增，然后对样品进行混合，选择需要的片段进行文库构建。利用Illumina HiSeq2500测序平台，进行双末端Paired-End125测序： 1) 酶切：0.1-1μg基因组DNA用限制性内切酶进行酶切，以得到适合的marker密度； 2) 加P1和P2接头：酶切后的片段两端加 P1和P2 Adapter（可与酶切DNA缺口互补）；? 3) 片断选择：PCR扩增两端分别含有P1和P2接头的tag序列，DNA片段pooling，电泳回收需要区间的DNA； 5) 高通量测序：Cluster制备，上机测序。 图2 GBS 实验流程 3 信息分析 .1 数据质控 文库质控：对文库的插入片段及污染进行评估，保证文库的整体质量； 测序质控：原始测序数据中会包含接头信息，低质量碱基，未测出的碱基（以N表示），这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，通过精细的过滤方法将这些干扰信息去除掉，最终得到的数据即为有效数据； RAD tag分析：分析有效RAD tag数量与平均测序深度等。分析有效 tag数量与平均测序深度等。 数据统计：结果包括测序reads数量，有效数据产量（包含酶切序列的高质量数据），测序错误率，Q20，Q30，GC含量等；测序数据指标：Q20%=90%，Q30%=85%。 通过以上严格的质控过程得到数量及质量都达标的数据，用于后续的分析。 图4 测序GC含量、错误率、质量分布图 表1．亲本测序数据产出统计 Novogene N. Raw reads Raw base(G) Clean base(G) Error rate(%) Q20(%) Q30(%) GC(%) 0.02;0.03 98.40;96.97 94.57;92.55 35.59;35.60 0.02;0.03 98.30;97.00 94.29;92.55 36.26;35.70 图5 子代数据产量分布 .2 与参考基因组比对软件，将两个亲本的数据分别和参考序列进行比对，对和覆盖度进行统计，查看研究的种和已经发表的参考序列的相似程度，如果较低（%）则将亲本的数据进行tag聚类及局部组装，作为参考序列。 图6 RAD的contig组装结果长度分布 3.3 SNP标记检测及筛选 SNP（单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性， 包含单个碱基的转换、巅换等。采用SAMtools进行个体SNP的检测，每个SNP的碱基支持情况不同，对亲本SNP深度进行分布统计，结果示例如图所示。为了降低SNP检测的假阳性，对SNP进行深度过滤。 父本母本 图SNP深度分布 .4 亲本之间多态性分析 Type Paternal genotype Maternal geno