大鼠Trail基因慢病毒载体的构建和鉴定.pdfVIP

目录 1 大鼠Trail 基因慢病毒载体的构建及鉴定…………….2 1.1.1 中文摘要………………………………………………2-3 1.1.2 英文摘要………………………………………………3-4 1.2 前言……………………………………………………4-5 1.3 流程图5-6 1.4.1 实验材料………………………………………………6-9 1.4.2 实验方法………………………………………………9-26 1.4.3 实验结果……………………………………………..26-34 1.5 讨论…………………………………………………...34-41 1.6 结论…………………………………………………42 1.7.1 参考文献……………………………………………..42-43 1.7.2 英汉缩略词对照表…………………………………..44-45 1.7.3 致谢…………………………………………………...45-47 1.8 TRAIL 研究现状（综述一）„„„„„„„„„47-58 1.9 慢病毒载体的构建与应用进展(综述二)…………. 大鼠Trail 基因慢病毒载体的构建及鉴定 摘要 目的:本实验用PCR法扩增出的Trail基因引入慢病毒载体系统，生产 Trail慢病毒颗粒并进行病毒滴度检测。方法: 1.Trail基因的获得：根据 2 GenBank 中大鼠Trail基因序列(NM 145681.1) ，设计出该基因的特异性引物 Trail-Agel-F和Trail-Agel-R ，并且使用Agel酶的切位点。用PCR法从大鼠 cDNA文库中扩增出目的基因。2. 重组质粒的构建：采用In-Fusion技术，将 酶切回收后的PCR产物线性交换连接入Agel酶切的真核表达载（GV218 ）， 产生目的重组质粒。连接产物质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，扩增目 的重组质粒。3.连接产物的酶切鉴定：收集扩增后的连接产物，酶切后经 电泳发现得到片段长度均与预期相符，基因测序结果亦正确，从而证明克 隆Trail基因已成功。4. 重组质粒转染293T细胞：用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，三质粒共同转染293T细胞，产 生含有表达Trail蛋白的Lentivirus病毒颗粒。5. 病毒检测：重组质粒转入 293T 细胞, 荧光显微镜下观察GFP 的表达，行Western blot 鉴定及使用 Real-time 定量PCR法检测病毒滴度。结果:成功得到Trail 目的基因，重组质 粒测序结果与GenBank 中Trail基因序列(NM 145681.1) 比较，证实Trail基因 序列正确；三质粒转染293T细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光；Western Blot检测观察到58 KD 附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻 合；孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2E十8TU/ml。 结论:成功克隆大鼠Trail基因和成功构建慢病毒载体系统并检测其滴度。为 后续把有杀灭肿瘤的基因（Trail ）转导进神经干细胞奠定基础。 关键词:慢病毒，载体，Trail，基因 Construction and identification of rat Trail gene recombinant lentivirus vector 3 . Abstract ：Objective: this experiment using the method of PCR amplified Trail gene into slow virus vector system, the production of Trail virus particles and virus titer. Methods: the1.Trail gene was obtained: according to GenBank i