构建含有小IRES及报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系.pdfVIP

11111 1 III II UII l l II IIf 、tI800580 目 录 中文摘要…………………………………………．1 英文摘要……………………………………．……5 研究论文构建含有小IRES和报告基因的新型HCV 亚基因复制子细胞系 前言……………………………．……………10 刚舌……………………………．……………上U 材料和方法……………………………………．12 结果…………………………………………．18 附图…………………………………………．21 结论………………………．．………………．．28 讨论…………………………………………．29 参考文献………………………………………34 综述HCV复制子系统的研究进展及其应用………………．．36 个人简历…………………………………………．．44 中文摘要 构建含有小IRES和报告基因的新型HCV亚基因 复制子细胞系 摘 要 CVirus，HCV)感染率占全世界人口的 丙型肝炎病毒(Hepatitis 1％．2％，约占我国人口的3．2％，是急慢性肝病的主要致病因素之一，约 70％一80％的感染者转为慢性，其转归和肝硬化及肝细胞癌有密切关系【l】， 在美国，HCV感染已经成为重症肝病晚期进行肝移植的最主要原因。由 于其高流行性、病程的隐匿性和长期感染导致预后不良，丙型病毒性肝炎 成为一个严重的医学和社会经济学问题【2】。HCV是黄病毒科、丙型肝炎 病毒属的唯一成员，在1989年就被鉴定出来，并且引起了对HCV基因 结构、病毒蛋白结构和生化特征研究的热潮。但由于HCV基因组有显著 的序列变异，尤其是在E2包膜蛋白编码区的高变区，在全球范围内HCV 的基因型多达30个，另一方面HCV在体外自主复制水平极低，且其唯 一的可感染动物为黑猩猩，故缺少有效的细胞培养系统和经济的小动物模 型来研究HCV复制及其致病机制，严重阻碍了对HCV生命周期和筛选 抗病毒药物的研究。为克服这一困难，研究者们进行了大量的实验探索， 直到1999年才有了突破性的进展：建立了一个有效的细胞培养模型 ～HCV复制子系统(HCV RepliconSystem)[31。这个系统的基础是利用基 因工程构建的亚基因组HCVRNA转染人肝癌细胞系Huh．7细胞，且可在 此细胞中自主复制。 Ribosome 内源性核糖体结合位点(Internal EntrySite，IRES)是具有 高级结构RNA片段，负责细胞性蛋白翻译结构的形成和病毒蛋白产物的 合成。虽然病毒mRNA的IRES结构精密且有数百个核苷酸组成，但是有 一系列的证据表明小片段的核苷酸序列，无论是自然形成还是人工合成， 功能，比目前常用的EMCV mRNA的长度，如何用在HCV复制子的构建，将减少插入序列的长度， 从而能够构建一个高效表达HCVRNA并能够表达抗性基因和报告基因 中文摘要 的新型HCV亚基因复制子。 报告基因(ReporterGene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因， 也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。可通过IRES或与 其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产 物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。诸如海肾荧光素酶报告 Luciferase 基因(Renilla Gene)【5】、萤火虫荧光素酶报告基因 Reporter LuciferaseGene)、伊内酰胺酶报告基因(Beta (F