构建登革病毒NS1抗原拓扑图和建立ELISPOT微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体中和活性.pdfVIP

俐… 1㈣啾 构建登革病毒NS 1拓扑图及建立ELISPOT 微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体 中和活性 博士研究生：刘利东 指导教师：车小燕研究员 摘要 登革病毒(dengue fever，DF)、 DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的症状主要有登革热(dengue shock 登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合征(dengue syndrome，DSS)。 登革病毒的传播在早期较为局限，主要在热带和亚热带地区。但随着世界 经济的一体化和各国之间的交流增强，登革病毒的传播范围日益扩大，目前在 非洲、美洲、东南亚和西大平洋地区一百多个国家和地区均出现过登革病毒的 流行。调查数据显示，全世界每年约有0．5．1亿人感染登革病毒，出现登革出血 热症状的严重病例达50万人，2．2．5万人死亡，其中大多为儿童，死亡率为5％。 因此，登革病毒的感染已成为全球重要的公共卫生问题，如何有效控制感染是 解决这一问题的关键。 人体在感染登革病毒后，可以无症状，也可只出现类似感冒症状，可自愈， 稍重的是出现DF症状，这些病例主要出现在初次感染的患者，儿童患者多需 要住院治疗。有相当部分二次感染的患者可以出现严重的病症DHF／DSS。目前 摘要 还没有一个特异性的治疗方法，患者只能对症治疗，也缺乏有效的疫苗来防止 感染。根据目前的研究结果显示，出现DHF和DSS的主要原因是抗体依赖增 强(antibody．dependent 不同的血清型。研究认为，病人感染其中一型病毒后，免疫系统会产生众多对 各种血清型病毒有交叉反应的抗体，这些抗体短期内有一定的交叉保护性作用， 但并不具有长期保护性作用。相反的，这些与其他血清型病毒有交叉反应性的 非中和抗体或者是一些亚中和浓度抗体可能就是引起DHF／DSS的重要原因。这 些抗体与病毒颗粒结构蛋白结合后，不能阻止病毒进入细胞，而其Fc部分会与 某些细胞(如单核细胞或树突状细胞)膜上的Fc受体结合，这种结合有助于登 革热病毒进入细胞，增强细胞对病毒的摄取及病毒在细胞内的复制，导致感染 的增强，从而促使登革的严重疾病的发生。对于防止登革疾病传播的疫苗研发 中，如果仅对一型病毒进行抗感染保护，会在病人感染异型病毒时，产生的ADE 效应将会影响病人的生命。因此，各种类型的疫苗是否是引起ADE效应是登革 防疫研究中一个关键点。 登革病毒从首次分离至今，已有六十余年，但对其感染后疾病的防治还存 在较大困难。其中的最大障碍是对登革病毒感染后的机体免疫机制不明，研究 的针对性不能集中。登革病毒的基因组结构是单股正链RNA分子，长约 l1000nt，编码三个结构蛋白，分别为衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白 (E)，七个非结构蛋白(non．structure 靶细胞表面的病毒受体结合，参与病毒与细胞之间的膜融合。在非结构蛋白中， 虽然它们并不是成熟病毒颗粒的组成成份，但从目前的研究成果看来，它们在 病毒感染与机体的免疫过程中起重要的作用。其中特别受到重视的是NSl蛋白， 它是登革病毒中主要的非结构蛋白，通常有三个形式存在，一为分泌型，可以 直接由感染的细胞分泌到胞外，可用于登革病毒早期诊断指标。二为胞内型， 主要存在于细胞内生物腔膜上，三为膜型，存在于感染细胞膜上，它的功能推测 Ⅱ 博士学位论文 可以通过细胞毒作用，直接参与病毒的清除，另外，也可能在病毒RNA的复制 中起一定作用，但因为对其的蛋白结构未完成了解，与抗体的结合形式不清楚， 所以其真正功能还需进一步研究。在抗原蛋白的结构未完全阐明之前，可以利 用各种技术分析预测它们的二级结构，如冷冻电镜、酵母展示、点突变和多肽 结合位点分析等。本研究利