构象差异凝胶电泳检测单核苷酸多态性和其临床应用.pdfVIP

摘要 摘要 随着人类基因组计划的完成，越来越多的研究开始关注基因多态性在医学 方面的应用。要分析基因多态性，首先要得到DNA。口腔黏膜上皮细胞是分子 流行病学、法医学和遗传学研究中重要的DNA来源。目前有多种方法可以用 于口腔黏膜上皮细胞DNA的提取，各有其优缺点。还没有一种方法能满足安 全、快速、简便、经济、可靠的要求。盐析法是全血基因组DNA提取常用的 方法之一，具有简便快捷、经济安全、稳定可靠的特点。如果盐析法能用于口 腔黏膜上皮细胞DNA的提取，可能会是一种较好的口腔黏膜上皮细胞DNA的 提取方法。 作为人类基因组中最常见的遗传变异，单核苷酸多态性与疾病的发生、发 展、预后以及疾病治疗过程中药物的疗效和毒副作用之间的关系日益受到重视。 对SNPs的准确分型有助于疾病的预防、早期诊断和治疗。虽然目前有很多SNPs 的分型方法，但有的需要特殊的设备、有的需要昂贵的试剂、有的成本较高。 如果能用普通PAGE直接对SNPs进行分型，可大大降低实验成本，提高效率。 目的： 1、建立一种安全、快速、简便、经济、可靠的口腔拭子DNA提取方法。 2、建立一种能在普通实验室开展的准确、简便、快速、低成本、高通量的 SNPs分型方法。 3、应用建立的SNPs分型方法对临床样本进行分析。 方法： 1、以在本研究室做实验的志愿者提供的10支口腔拭子为例，用自己配制 的试剂进行DNA提取。用细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞，然后用 5mol／L NaCl沉淀蛋白质，用异丙醇沉淀DNA，最后用70％乙醇洗涤得到的 DNA并将其溶于TE中。用紫外分光光度计对得到的DNA进行浓度和纯度检 测。以得到的DNA为模板，用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性技术对两 个SNPs进行分型。对不同基因型的样本测序验证。 2、用自己建立的盐析法快速提取口腔拭子DNA的方法，对130例志愿者 提供的口腔拭子进行DNA提取。以2个方面来源的DNA为模板，对13个SNPs II 摘要 析。对可能影响SNPs分型的DNA片段自身因素、PCR扩增条件和电泳条件进 行优化，建立普通聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SNPs的方法。在检测条件优化的 基础上，对13个SNPs进行检测。为了进行高通量检测，还进行了复合扩增和 1块胶上分】0层上样。对所有的SNPs进行测序验证。对聚丙烯酰胺凝胶电泳 结果、酶切结果和测序结果进行比较。 3、用建立的SNPs分型方法对104例使用5一FU为基础的化疗的晚期胃癌 和3489+80CT)进行分析，并研究这3个位点多态性与化疗有效率之间的关 系。 结果： 1、建立的盐析法提取口腔拭子DNA所需时问在1小时左右，提取单支口 腔拭子DNA的全部费用不超过1，5元。单支口腔拭子得到的DNA量在0．6899～ 2．56 10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。 2、5个SNPs的酶切都得到了清楚分型。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SNPs 的优化结果显示：GC含量和碱基组成对电泳的影晌不大，而SNPs在片段中的 位置和扩增片段长度可能是影响聚丙烯酰胺凝胶电泳对SNPs分型的重要因素。 就PCR扩增来说，模板量、DNA聚合酶、退火温度、循环数都可能会影响聚 丙烯酰胺凝胶电泳对SNPs的分型。把这种以构象不同为基础的对SNPs分型的 方法称为构象差异凝胶电泳。对13个SNPs的分析显示有8个SNPs可以被直 接分型，2个SNPs不能直接被分型，3个SNPs因样本量小不能确定。此外， PCR产物10层上样电泳图显示至少有7层可以清楚地区分3种基因型。4个 SNPs的复合扩增也都得到了清楚的结果。DNA测序结果较好，证实了各扩增 片段为目的片段。构象差异凝胶电泳结果和酶切、DNA测序结果完全一致，证 III 摘要 明了构象差异凝胶电泳对SNPs分型的可靠性。与酶切相比，构象差异凝胶电 泳对SNPs的分型不需要内切酶，因此成本较低。与单链构象多态性相比，由 于构象差异凝胶电泳在PCR扩增后不需要对PCR产物进行变性，可以直接上 样，因此较单链构象多态性成本