抗MHCⅡ单克隆抗体对猪外周血混合淋巴细胞培养影响.pdfVIP

验中应用MLR模型，观察不同浓度抗MHCII单克隆抗体及混 合淋巴细胞培养时间对淋巴细胞增殖活化的影响。为下一步建立 猪原位肝移植模型观察抗MHCII单克隆抗体对急性排斥反应的 影响作准备。 二、材料与方法 (一)试剂与仪器 1． 主要试剂 1．1胎牛血清：G18C0。 1．2RPMI 1640培养液(GIBCO)。 I．3淋巴细胞分离液FlCoLL(PH7，2)上海生化厂出品。 1．4鼠抗猪MHCII单克隆抗体(2E9／13单克隆抗体，浓度 1mg／ml，英国SeroTec公司)。 1．5二甲基亚砜(DMSO，DimethlSulfoxide)：江苏洪声化工长 产品。分析纯。 I．6 Sigma公司产品。 1．7CFDA—SE散试剂盒购子Molecufarprobes公司。 2． 主要仪器设备 2．I倒置显微镜：OLYMPUSCK一2，日本产。 cell，Forma 2．2C02恒温培养箱：Hera SCientific公 司产品。 2．3流式细胞仪：B—D公司FACScan型。 MRtm 2．4酶标仪；0psys CB372。华美公司。 2．5可见光分光光度仪：721—100型，上海医疗仪器五厂。 2，6普通光学显微镜：OLYMPUS，日本产． 6 2．7超净工作台：医用净化工作台，YJ一875型。苏州净化 设备公司。 2．8低速自动平衡离心规：LDZ5—2型，北京医用离心机 厂。 2．9 品。 3．实验动物 小型猪 (二)方法 1．外周血分离单个核细胞： (1)分别取供体和受体猪外周静脉血20ML，用生理盐水将外 周血按l；1稀释。吹打混匀。 (2)取淋巴细胞分离液同外周血以l：l的比例加入试管中， 然后将试管倾斜45度角，用毛细吸管将血液在距淋巴细胞分离 液界面lem处沿试管壁缓慢加至分离液上面，注意保持两界面清 晰，勿使血液混入分离液中。 (3)离心(2500转，分)25分钟。 (4)取出试管，见其分为以下四层：上层为血浆及绝大多数血 小板：下层为红细胞及粒细胞；中层为淋巴细胞分离液；分离液与 血浆交界部位混浊的灰白色层即为淋巴细胞层。小心吸出灰白色 的淋巴细胞层放入离心管中，用5倍体积PBS液洗涤2次，依 次为l500r／min。1200r／min离心10分钟。 (5)用台盼兰染色后镜下数活细胞数，具体步骤：取100微升重 悬后的细胞用台盼兰染色3分钟后镜下计数活细胞数，活细胞数 95％。 基将其浓度调至调整细胞数为IX106／m1． 7 2．供体猪淋巴细胞的处理：种板：(24孔板)(供体猪) (1)细胞悬液分别加入丝裂霉素C，最终浓度为25ug／ml，置 钟，弃去上清液，用1640培养液洗涤细胞2次，将细胞数调整为 1×10。／ml作为刺激细胞。 (2)刺激细胞的处理： 供者淋巴细胞的处理在24孔板上。种板设未经处理供体细 胞组第l组，抗体处理组。抗体处理组又设五个浓度梯度，分别 体淋巴细胞和不同浓度的抗体，空白对照组第l组(既未处理组) 加入等体积的RPMI1640培养液，种板后放入370C。5％C02的 培养箱中孵育两个小时后经PBS液洗涤三次。重新将淋巴细胞 浓度调整为1×106／ml备用。 3．反应细胞的制备： 将用FICOLL分离的受者猪淋巴细胞计数后按每孔l×106细 胞的数量种板后放入370C，5％C02的培养箱中孵育两个小时， 备用。 4．混合淋巴细胞的培养： 共分为A，B，C，D，E，F，G，H，共8组，A组为经丝裂霉素C处理的 供体游巴细胞100ul加等量RPMI1640培养液在一个孔中，B组 为受体淋巴细胞1