第三方骨髓间充值干细胞对同种异体皮肤移植的作用.pdfVIP

第三方骨髓间充质干细胞对同种异体皮肤移植的影响 摘 要 marrow—derived 目的：通过建立第三方骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem 理对同种异体皮肤移植存活时间的影响，探讨第三方BM-MSCs对同种异体皮肤移植的 影响。 方法： I、BMSCs的分离、培养和纯化 将SD大鼠腹腔麻醉，无菌条件下制取股骨骨髓单细胞悬液，接种于含有培养液 的培养瓶中进行培养。3d后除去非贴壁细胞，观察细胞形态及生长情况，待细胞铺 满后进行传代。取3代后的细胞调整浓度备用。 2、同种异体皮肤移植的动物模型 小鼠50只为皮肤移植的受体，C57BL／6小鼠40只为皮肤移植的供体。应用钳夹法切 去全厚皮肤，修剪成皮片，移植于受体创面处，经过练习熟练地操作，保证移植的成 功。 3、各组受体小鼠移植皮肤存活时间、病理变化 BALB／C小鼠(受体)随机分为5组，每组10只：空白对照组，即直接进行皮肤移 标记组。前4组给予相应干预后随即接受C57BL／6小鼠(供体)皮肤移植。术后观察 小鼠皮肤移植的存活时间，皮肤的病理变化。 4、外周血中第三方骨髓间充质干细胞的含量及体内分布 静脉注射，观察染色后的细胞生长情况和第7、14、30天小鼠体内的红色荧光细胞的 存在部位。应用流式细胞术检测外周血中DiI荧光标记的细胞的含量。 5、混合淋巴细胞增殖抑制试验 将培养的BMSCs调节细胞的浓度加入96孔培养板中，待贴壁后再加入受体小鼠的 脾淋巴悬液，培养箱培养后，加入MTT，培养时间到后上机检测。 结果： 1、SD-BMSCs体外分离培养倒置相差显微镜下观察刚接种的骨髓中体积较大的单核 细胞呈球形，悬浮于培养液中。48h少数细胞呈成纤维细胞样外形，以后细胞呈克隆 样生长。3～4d开始迅速生长，12d左右细胞达到单层汇合的80％一--90％，细胞呈比 较均一的梭形，成纤维样细胞样生长，形成旋涡状。 2、小鼠移植皮肤存活时间：后3组皮肤移植物存活时间均比空白对照组延长(PO．05)： d。 CP+SD-BMSCs组皮片存活最长达18 3、组织学观察皮肤移植后7d大体观察发现空白对照组大部分已经结痂坏死，CP 色观察：空白对照组皮肤有大量炎性细胞浸润，无血管形成：CP组炎性细胞浸润较少， 并有少量血管形成；SD-BMSCs组炎性细胞浸润也较多，但有新生血管形成；CP +SD—BMSCs组炎性细胞浸润少，同时也有血管生成。 4、CM-Di I荧光标记SD-BMSCs移植后的观察：CM-DiI荧光染料染色后细胞大部分着 色，继续培养的细胞具有良好的形态，并保持分裂状态。尾静脉注射后14d肺组织 6 内依然观察到大量荧光细胞，并且脾脏内也观察到大量荧光细胞，同时移植皮肤内也 观察到少量荧光细胞。30 d肺组织内依然观察到荧光细胞，其他器官没有观察到荧光 细胞。 5、SO—BMSCS流式细胞仪检测结果 受体外周血单核细胞中SD—BMSCs的含量随着时 间的推移逐渐减少，7、14、30d 6、混合淋巴细胞增殖抑制试验SD-BMSCs对混合淋巴细胞反应中的T淋巴细胞的增 殖具有抑制作用，随着细胞比例的减小，抑制作用逐渐减低。单独淋巴细胞组与l： i00组、淋巴细胞+删C组与1：1组分别比较差异无统计学意义(乃0．05)，其余各组 间进行比较差异具有统计学差异(尺0．05，n=5)。 结论： 1、BMSCs能够在异种受体体内存活较长时间； 2、第三方BMSCs能够延长同种异体移植物的存活时间，并且和免疫抑制剂具有协 同作用； 3、BMSCs能够抑制异种T淋巴细胞的活化增殖，而且随着MSCS数目的增多，抑制 作用越明显． 关键词：骨髓间充质干细胞；移植，同种； 皮肤移植：免疫耐受 7 of bonemarrow stemcellson Imp