肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建和在肝星状细胞中的表达.pdfVIP

肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建及 在肝星状细胞中的表达 摘 要 tissue 目的：结缔组织生长因子(connectivegrowth factor growth stellate 原代肝星状细胞(hepaticcell，HSC)活化、增殖及迁移，还能促进活 化HSC的合成及分泌细胞外基质(extracellular inhibitor 组织抑制因子l(tissueofmetalloproteinase 号传导途径的下游效应介质，在肝纤维化发生时，它主要由激活的HSC表 达。TIMP．1不仅抑制基质金属蛋白酶(matrix 阻止胶原降解，也通过抑制HSC凋亡、促进胶原分泌而在肝纤维化病情进 展中发挥关键作用。所以，减少CTGF和TIMP．1的表达，可以减轻肝纤维 (short RNA，shRNA)表达载体，为进一步探索肝纤维化的基因治 hairpin 疗提供有力工具。方法：根据前期筛选出的对CTGF和TIMP．1基因最有效 按照RNA干扰(RNA 发夹结构的RNAi靶点序列，退火形成双链DNA，分别克隆到经双酶切后 外复苏培养大鼠的肝星状细胞，取对数生长期细胞O．25％胰蛋白酶消化， Transfmlection 培养基培养同步化，利用脂质体(TransFast 染情况，用流式细胞仪测转染的效率。结果：1、证实以大鼠CTGF或TIMP．1 基因为靶点的表达shRNA的目的基因片段分别被成功的克隆到质粒载体 靶基因片段完全一致。2：用瞬时转染肝星状细胞后荧光显微镜观察，在转 染进质粒的细胞全部发绿色荧光，初步证实能转染进肝星状细胞。结论： 质粒重组体。瞬时转染到转染大鼠的肝星状细胞，在荧光显微镜能发现带 有荧光的细胞，说明成功转染进肝星状细胞。这样为进一步探索肝纤维化 基因治疗的新途径打下了实验基础。 关键词：RNA干扰；肝纤维化；质粒载体；结缔组织生长因子；金属 蛋白酶组织抑制因子．1；肝星状细胞。 stellateceHs hepatic tissue a Abstract：bjective：Connective growth factor(CTGF)isrecently discovered of importantc舛ol【ine fibrosis，whichisa promotinghepatic transforminggrowth transductiondownstream factor-13(TGF-13)signal pathway effect callnot mediate factor，and only stellatecell directly primaryhepatic and also theHSCto (HSC)activation，proliferation migration，but