过表达Nanog基因的小鼠骨髓间质干细胞对帕金森病小鼠NF-κB表达的作用.pdfVIP

摘要 过表达Nanog基因的小鼠骨链间质干细胞对帕金森病小鼠 NF．KB表达的影响 硕士生：黄志新 专业：神经病学 导师：张志坚 帕金森病成为困扰许多中老年人的常见病，目前还没有一个有效的方法能阻 止本病的进展。近年来，随着对该病研究的进一步深入，晟终治疗将寄希望于新 技术的成熟，如基因治疗和干细胞治疗。尤其，多项研究发现帕金森病与NF．r,B Cell 的过度表达有关。2008年Torres等在Nat Bi01．发表论著，发现Nanog基因 可抑制NF．r,B的表达。为充分应用这一发现，本课题组已经通过限制性内切酶 酶切和基因重组的方法，成功构建携带Nanog基因的重组慢病毒表达载体质粒 感染小鼠骨髓间质干细胞，观察过表达的Nanog对NF-KB表达的影响，为神经 变性疾病的治疗提供新思路。本课题分三部分。 第一部分：过表达Nanog基因的骨髓问质干细胞的构建、培养与鉴定 1、 方法： pVSVC共转染293T细胞，包装生产慢病毒； (2)经超速离心收集病毒颗粒，转染293T细胞，用流式细胞术测定EGFP 蛋白表达率来测定慢病毒功能滴度； (3)分别用携带相应目的基因的相同滴度慢病毒感染mMSCs： (4)用RT-PCR、Western 蛋白质，以及该细胞上清液中Nanog表达水平。 2、 结果： 4 pVSVG共转染293T细胞，包装产生慢病毒。 (2)未浓缩含病毒的细胞培养上清和浓缩的病毒悬液的功能滴度分别是 TU／mL和6．8×106TU／mL。 6．5×104 (3)RT-PCR、Western 表达增多，与空载体组相比较差异性有显著意义。 3、 结论： 成功构建过表达Nanog基因的mMSCs。 第二部分：mMSCs过表达Nanog基因对NF-r,B表达的影响 l、方法： 中，感染mMSCs，荧光显微镜观察表达情况。 感染的mMSCs组，mMSCs组为未经慢病毒感染的mMSCs组。 (3)检测感染后的各组mMSCs中Nanog及NF—r．B的表达情况。 2、 结果： 表达。 (2)细胞免疫荧光、RT-PCR和Western 组NF-r．Bp65表达量高于Nanog—mMSCs组。 3、结论： 在mMSCs培养的体外实验中，过表达Nanog能抑制NF．r,B表达 第三部分：过表达Nanog基因的mMSCs对帕金森病小鼠NF．KB 表达的影响 1、方法： 型。 注射到模型鼠纹状体，对照组只注射PBS。 (3)取小鼠脑制作冰冻切片在荧光显微镜下观察各组的NF．r,B在黑质、纹 状体的表达情况，以及观察黑质多巴胺能神经元的数量。 2、 结果： (1)成功建立帕金森病小鼠模型。 数量多于其他两组。 3、结论： 在帕金森病动物模型上，Nanog抑制NF一心表达，可能有保护黑质多巴胺 能神经元的作用。 NF一1cB慢病毒载体骨髓间质干细胞 关键词：Nanog 6 ABSTRACT cells inmouse stem OverexpressionofNanoggene mesenchymal inmouse andi