靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS 基因表达的探究.pdfVIP

目 录 1 靶向siRNA 体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS 基因表达 的研究…………………………………………………………1 1.1 中文摘要………………………………………………………1 1.2 英文摘要………………………………………………………4 1.3 前言……………………………………………………………7 1.4 材料与方法……………………………………………………10 1.5 结果……………………………………………………………23 1.6 讨论……………………………………………………………27 1.7 结论……………………………………………………………34 1.8 参考文献………………………………………………………35 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………42 2 致谢……………………………………………………………43 3 siRNA 的合成及导入方法研究进展 （综述）………………44 2 靶向siRNA 体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞 MAS 基因表达的研究 摘 要 目的：探讨体外直接转染以大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F ） MAS 基因为靶标的小干扰RNA （small interferingRNA，siRNA ）后， NRK-49F 的MAS 基因的mRNA 表达和蛋白水平是否受到抑制，筛 选出高效的siRNA，为进一步研究MAS 基因在肾脏疾病中的作用机 制提供实验基础。方法：（1）靶向MAS 基因的siRNA 的设计及合成： 通过NCBI 检索大鼠MAS 基因序列，按照siRNA 序列设计原则设计 并合成特异性沉默MAS 的siRNA3 对：siRNA-1 （5-CCUGACCAGA GCUUUCAAATT - 3，5- UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT -3 ）、siR NA-2 （5- GACCAAUCAAAUAUGACAUTT - 3，5- AUGUCAUA UUUGAUUGGUCTT -3 ）、siRNA-3 （5- GCCAUUACUACACAAUC GUTT- 3，5- ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT -3 ）；阴性对照siRNA （siRNA-neg ）（5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT - 3，5- ACGU GACACGUUCGGAGAATT -3 ）1 对。（2 ）细胞培养：NRK-49F 细胞 置于DMEM /F12 培养基中 （含有l0 ％胎牛血清、100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素），在37℃、5%CO2 的无菌培养箱中，用0.25%胰 酶消化传代，待细胞悬液内的细胞呈对数生长后，将细胞制成 5 1×10 /ml 的细胞悬液接种于6 孔培养板进行实验。（3 ）实验分组: ① MAS siRNA-1 ：加入含 siRNA 序列 1 的 转染混合物 （transfection complexes，TC ）；②MAS siRNA-2 ：加入含siRNA 序 列2 的TC ；③MAS siRNA-3 ：加入含siRNA 序列3 的TC ；④ 阴性 对照组（CG ）：加入含siRNA 阴性序列的TC ；⑤ 空白对照组(NG) ： 1 只加入转染试剂；每组设3 个复孔。（4 ）转染：将HiPerFect Transfection Reagent 12ul 与无血清无双抗培养液混合，配成100ul 转染液后，再 加入终浓度为 10nM 的siRNA,两者混匀常温孵育5-10 分钟。将转染 混合物加入六孔板中，轻轻晃动保证转染混合物分布均匀，恒温箱中 孵育，48 小时后检测转染效率。 （5 ）基因表达检测：应用反转录酶 聚合酶链式反应（rever-setranscription -polymerase chain reaction ， RT-PCR ）与蛋白质印迹法（Western b