苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素严重程度分析.docVIP

苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素严重程度分析 　　苦玄参（Picria felterrae Lour.）又名苦草、鱼胆草、四环素草、蛇总管，为玄参科苦玄参属植物，以全草入药，是《中华人民共和国药典》收载品种[1]，主要分布于广西、广东及云南等地，在广西民间作药用已有200多年的历史[2]。 　苦玄参作为广西大宗、道地药材，是广西梧州制药（集团）股份有限公司生产的妇炎净胶囊的主要原料药材，也是广西多家制药企业生产的炎肿化毒片、炎见宁片、万通炎康片、维威消炎灵等多种中成药的原料药材[3]。随着医药市场需求的逐年增加，苦玄参在广西梧州地区广泛栽培。调查发现，近年来苦玄参褐斑病在梧州各栽培区普遍发生，造成叶斑、叶片枯黄，严重者叶片全部卷缩，植株枯死。国内外关于苦玄参病害的研究尚未见报道，褐斑病为首次报道的苦玄参病害。明确苦玄参褐斑病病原菌对于该病害的预防与控制具有重要意义。 　环境因素对病害的发生流行起着重要作用，就光照与苦玄参褐斑病的关系进行探讨，可以阐明光照在该病害的发生中的作用，以指导生产。 　1 材料和方法 　1.1 病菌采样与分离、纯化 　苦玄参褐斑病典型病叶采自广西梧州市岭角镇武烈村。病原菌的分离及纯化参照文献[4]。采集的病叶用清水洗净，剪取病叶组织（边长4～5 mm的正方形），用75%的乙醇消毒2～3 s，0.1%氯化汞消毒2 min，无菌水冲洗3遍，置于灭菌滤纸上吸干水，将病叶组织接种在马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基上，26 ℃恒温培养4 d，对分离物归类、编号。纯化培养采用单孢分离法纯化产孢真菌，采用多次挑取菌落边缘菌丝转皿纯化不产孢真菌，纯化后的真菌转管保存。 　1.2 致病性测定[4] 　将纯化菌株接种至PDA琼脂培养基，在28 ℃、相对湿度65%霉菌培养箱内培养5 d，用打孔器制备直径9 mm的菌饼。用无菌接种针在健康的离体苦玄参叶片上刺成面积约为1 cm2的伤口，用接种铲将菌饼接至伤口，保湿培养3～4 d，观察发病情况。根据柯赫氏法则，对发病叶片病菌进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。以接种PDA培养基作为对照，在室温（20～25 ℃）下保湿培养5 d，记录发病情况。 　1.3 形态学鉴定 　将致病菌株移至PDA平板上28 ℃下培养，玻片培养法观察，记载病原菌的形态特征，以病原菌菌落形态、病害症状为依据鉴定病原菌种属[4]。 　1.4 核糖体rDNA-ITS序列分析 　采用SDS法提取病原菌株的基因组DNA[5]。采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS4（5prime;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3prime;）和ITS5（5prime;-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3prime;）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）扩增该菌的rDNA-ITS序列。扩增产物的纯化和测序委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，将得到的序列在GenBank中进行同源性比较[6]。 　1.5 光照对病害的影响 　选择除光照条件不同外，土壤、栽培管理等其他条件均一致的栽培地，采用LI-1400型便携式光量子辐射计分别测定各栽培地的光照强度。对不同光照条件下的苦玄参进行发病情况调查，每地块随机调查5个点，每个点查20株，每株调查10张叶片，调查叶片病级情况（分级标准见表1），统计发病株数及病情指数[7]。 　病情指数=（各级病级代表值times;该病级病叶数）/（调查叶片数times;发病最重级代表值）times;100。 　2 结果和分析 　2.1 病害症状 　苦玄参褐斑病在广西梧州始于5月初，苗期可见症状发生，但为害不严重。6月下旬至8月是苦玄参的田间生长旺期，也是病害发生高峰期。多从靠近心叶的2～3片叶片开始发病，受害叶片初期病部呈水渍状淡黄小点，病斑不断扩大，形成不规则黄褐色斑块，大小为0.2～0.4 cmtimes;0.5～0.8 cm，病健交界处为紫褐色（图1a）。天气或环境潮湿时，病叶呈水渍状；天气或环境干燥时病斑穿孔。后期病斑连片，病叶卷缩，呈火烧状。 　2.2 病原菌鉴定 　2.2.1 病原菌分离、纯化 患褐斑病苦玄参组织26 ℃恒温培养3～4 d后长出菌落，共分离到5株真菌菌株。 　2.2.2 致病性测定 将分离所得的5株菌株室内接种至健康的离体苦玄参叶片上保湿培养5 d，仅K-1-2菌株接种的发病（图1a），其他未发病。发病叶片表现出明显的褐色水渍状斑点，对病叶进行病菌再分离接种，获得与原分离菌株一致的菌株。根据柯赫氏法则，确定试验中分离的K-1-2菌株为苦玄参褐斑病的病原菌。 　2.2.3 病原菌的形态特征 菌株K-1-2在PDA琼脂培养基上的菌落呈圆形，有同心轮纹（图1b），初期菌丝白色，6