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转Bt基因抗虫水稻探究现状分析 　　本文转载《天津农业科学》 中图分类号： S511 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2012.06.003 　水稻（Oryza sativa） 是世界上最重要的粮食作物之一，全球近半数人以稻米为食。2001─2025年，世界对水稻的需求量大致每年增加1%，相当于这一时期亚洲人口的增长率。世界上水稻的种植范围很广，其中中国是最大的产稻国，其水稻产量占世界稻米总产量的1/3[1]，因此，水稻种植带来的产值在我国国民经济中占有十分重要的位置。与此同时，水稻同样也是受到害虫侵害最为严重的农作物之一[2]。长期以来，为害我国水稻的主要害虫有螟虫（稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟）和稻飞虱，主要病害有稻瘟病、白叶枯病、纹枯病等[3]，每年因虫害造成水稻产量损失约为10%[4]。在过去的几十年中，化学防治一直是水稻害虫防治的主要方法，但在减轻害虫危害、提高水稻产量的同时也产生了新的问题。化学杀虫剂的长期使用造成了严重的环境污染、生态的失衡、生产成本提高、水稻品质下降以及害虫本身产生抗药性等问题。随着植物分子生物学技术和基因工程技术的飞速发展，有大量文献报道，培育自身具有高抗虫性的水稻已成为现实[5-9]。 　1 Bt基因及转Bt基因抗虫水稻的作用机理 　1.1 Bt基因的简介 　Bt基因即苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）基因，由于其具有杀虫效果好、安全性高、高效等优点，已成为现今世界上应用最为广泛和最有应用前景的抗虫基因。首次发现苏云金芽孢杆菌是在1902年，发现该菌的学者是日本生物学家Shigetane Ishiwatari；再次分离出该杆菌是在1911年的德国苏云金省，分离出该杆菌的学者是Ernst Berline，并将该菌命名为苏云金芽胞杆菌[10-11]。苏云金芽孢杆菌是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，其主要的杀虫活性成分”“杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins， ICP），也称为delta;-内毒素，是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的。典型的ICP由两部分组成，N端的活性片段和C端的结构片段，编码杀虫晶体蛋白的基因通称为Bt或Cry基因。许多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性，由Crickmore等人组成的Bt基因命名委员会在1995年召开的无脊椎动物病理会年会上提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系。同源性在45%以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45%～78%之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78%～95%之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95%以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示，例如Cry1Aa1基因[12]。自1981年Schnepf等[13]首次克隆出Cry （crystal protein gene）基因以来，新的Bt基因不断地被发现，截止2012年8月，Bt基因已达到73个大类，总计667个基因序列[14]。这些杀虫晶体蛋白可作用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目等靶标昆虫和线虫，还能溶解细胞。 　1.2 转Bt基因水稻的抗虫机理 　经转基因技术将Bt毒蛋白导入水稻后，一般认为Bt毒蛋白的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道的形成5个环节[15]。研究表明，Bt毒蛋白可溶解于pH值大于12或pH值小于9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中[16]。鳞翅目昆虫幼虫中肠的pH值呈碱性，有利于Bt毒蛋白的溶解，这也是苏云金芽孢杆菌对鳞翅目昆虫有高效毒杀作用的原因之一。Bt毒蛋白的重要杀虫成分ICP自身没有生物活性，又名原毒素（protoxin） ，通过昆虫的取食可在昆虫中肠的碱性环境中被溶解，溶解的Bt毒蛋白被中肠蛋白酶水解为毒素核心肽段，这些活力肽段能与中肠上皮的特异性受体专一性结合，进而毒蛋白插入细胞膜中形成孔洞或离子通道，使膜的完整性遭到破坏，引起细胞渗透失衡，细胞膨胀并溶解，最终导致昆虫死亡。 　对Bt毒蛋白导致害虫死亡的组织病理学研究表明，二化螟5龄幼虫取食转Bt（Cry1Ab）基因抗虫水稻后，中肠上皮细胞中的细胞器会发生很大的变化，如线粒体和内质网的形态会发生明显变化，在病变的过程中会出现粗糙内质网的肿胀和核糖体脱落等现象。与对照相比，取食Bt水稻后的二化螟幼虫肠道内弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性呈下降趋势，而强碱性类胰蛋白酶的活性则呈上升趋势[17]。在正常的稻纵卷叶螟3龄和5龄幼虫肠道内，中肠上皮柱状细胞顶部的微绒毛数量比较多，细胞质均匀， 细胞器丰富。当这些稻纵卷叶螟幼虫取食Bt水稻后，柱状细胞的微绒毛有脱落现象，且随着取食时间的增加，中肠上皮细胞中的细胞质透明化，细胞器