饲料中植物酶检测.docVIP

饲料中植物酶检测 0 引言 酶是生物机体合成具有特异功能的蛋白质，它的主要功能是催化机体内的生化反应，促进机体的新陈代谢，对促进机体的生长发育有着重要作用。 目前使用的酶制剂主要是消化酶，要用于幼龄动物，目的是促进饲料的消化和吸收，以弥补消化酶分泌的不足，提高养分的消化率; 用于成年动物，是为了提高消化功能和弥补因应激等原因消化酶分泌的减少。作为饲料添加剂使用的主要酶制剂有蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶等单一酶制剂和混合酶制剂。 酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选酶制剂的优劣，在实际操作中，我们摸索出了较为方便的操作方法，操作步骤相对简单、检测所用时间短，便于生产实践应用。本文以植酸酶为研究对象，研究植酸酶的最适反应温度、最适反应pH,pH的稳定性、底物的浓度对酶活性检测的影响，为植酸酶在畜禽日粮中的应用提供基础理论依据。 1 饲料中植物酶的检测 1.1 植酸酶活性单位定义 样品在植酸钠底物浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.00的条件下，每分钟从植酸钠中释放1umol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。 1.2 方法原理 植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸氨处理会生成黄色的【（NH4）3PO4NH4VO3·16MOO3】复合物，在波长415nm下进行比色测定。 1.3 试剂和溶液 1.3.1 0.25mol/L乙酸缓冲液(1) 称取34.02 g 三水乙酸钠于1000mL 容量瓶中，加入900mL 水溶解，用冰醋酸调节pH 值至放2个月有效。 1.3.2 0.25mol/L乙酸缓冲液(2) 称取34.02 g三水乙酸钠，0.5 gTritonX-100，0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL 水溶解，用冰醋酸调节pH 值至5.00plusmn;0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。 1.3.3 7.5mmol/L植酸钠溶液 称取0.6929 g 肌醇六磷酸钠（C6H6O24P6Na12）于100mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(1)溶解并定容至刻度，用冰醋酸调节pH至5.00plusmn;0.01，现用现配。( 实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L) 1.3.4 100g/L钼酸铵溶液 称取10 g 钼酸铵〔(NH4)6MO7O24·4H2O〕于100mL容量瓶中加入1.0mL氨水(25%)用水溶解定容至刻度,注意直至溶液完全溶解澄清才可使用。 1.3.5 2.35g/L钒酸铵溶液 称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2mL硝酸溶液(1.3.4)，用水溶解定容至刻度，避光条件下保存1周有效。 1.3.6 硝酸溶液 1+2 水溶液(1 体积硝酸与2 体积纯水相混溶)。 1.3.7 颜色终止液 移取2 份硝酸溶液（1.3.6）,1 份钼酸铵溶液(1.3.4) ,1份钒酸铵溶液(1.3.5)混合后使用，现用现配（注意：不要出现沉淀，加硝酸要慢）。 磷酸二氢钾(KH2PO4)基准物。 1.4 仪器设备 ①实验室常用仪器设备； ②恒温水浴箱:37plusmn;1℃； ③分光光度计：有10nm比色皿,可在415nm下测定吸光度； ④磁力搅拌器； ⑤涡流式混合器； ⑥酸度计：精确至小数点后2位； ⑦离心机：转速为4000r/min以上。 1.5 试样制备 取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛,装入密封容器,防止试样成分变化。 1.6 测定步骤 1.6.1 标准曲线 准确称取0.6804 g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液（2）溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L按下面表1的比例稀释成不同浓度与试样一起反应测定，以无机磷的浓度为纵座标，吸光值为横座标，列出直线回归方程（y=ax+b）。 1.6.2 试样溶液的制备 称取样品5000U/g 的0.4~0.6 g，精确至0.0001g，置于250mL三角瓶中，准确加入100mL乙酸缓冲液（2），放到空气浴摇床上振荡30min或磁力搅拌器上高速搅拌30 min，在离心机上以4000r/min离心10 min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（2）稀释，使样液浓度保持在0.4U/mL左右，待反应。 建议精确移取上清液1mL 至25mL 容量瓶中，用乙酸缓冲液（2）定容，摇匀。再继续精确移取1mL试液至25mL容量瓶中，定容，摇匀，稀释至31250倍。