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2017-09-06 发布于贵州
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利用RNA干技术抑制日本血吸虫酪氨酸羟化酶的合成.pdf

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利用RNA干技术抑制日本血吸虫酪氨酸羟化酶的合成

目录中英文缩略词对照表………………………………………………………………...3 中文摘要……………………………………………………………………………...5 英文摘要……………………………………………………………………………...8 1. 前言…………………………………………………………………………11 2. 材料方法……………………………………………………………………14 2.1 材料和试剂………………………………………………………………..14 2.1.1 钉螺…………………………………………………………………..14 2.1.2 小鼠…………………………………………………………………..14 2.1.3 引物和探针…………………………………………………………..14 2.1.4 主要试剂……………………………………………………………..15 2.1.5 部分试剂的配方……………………………………………………..15 2.1.6 主要仪器及来源……………………………………………………..20 2.2 实验方法………………………………………………………………….22 2.2.1 日本血吸虫尾蚴的收集……………………………………………..22 2.2.2 日本血吸虫尾蚴总RNA 提取………………………………………22 2.2.3 逆转录合成第一链 cDNA…………………………………………...22 2.2.4 SjTH 基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备……………………..23. 2.2.5 SjTH 、Sj14-3-3、LacZ 长片段 dsRNA 体外转录、纯化…………..28 2.2.6 dsRNA 转染入日本血吸虫尾蚴……………………………………...35. 2.2.7 测定 RNA 纯度………………………………………………………36. 2.2.8 GAPDH 目的基因的扩增…………………………………………….36 2.2.9 dsRNA 处理后的日本血吸虫感染小鼠……………………………...37 3. 结果…………………………………………………………………………….. 37 3.1 SjTHj 基因表达质粒的鉴定………………………………………………...37 3.2 SjTH 基因的原核表达…………………………………………………38 3.3 长片段 dsRNA 体外转录结果…………………………………………...39 3.3.1 目的基因的扩增…………………………………………………….39 1 3.3.2 目的基因正义DNA 模板及反义 DNA 模板的扩增……………..41 3.3.3 以正义DNA 及反义 DNA 为模板体外转录产生 dsRNA……….44 3.4 体外转录长片段 dsRNA 对 SjTH 基因转录的抑制作用……………44 3.5 体外转录长片段 Sj14-3-3 dsRNA 对 Sj14-3-3 基因转录的抑制作用…46 3.6 Western blotting 检测各处理组中 SjTH 蛋白的表达……………………48 3.7 显微镜观察日本血吸虫尾蚴的结果………………………………...…..50 3.8 感染日本血吸虫尾蚴肝脏病理切片（HE 染色）……………………...51 4. 结果…………………………………………………………………………52 4.1 RNA 干扰的机制………………………………………………………52 4.2 选择 RNAi 方法检测基因功能……….………………………………52 4.3 长片段 dsRNA 在日本血吸虫体内能抑制目标基因的表达…………..53 4.4 影响长片段 dsRNA 对目标基因表达调控作用的因素………………..54 4.5 长片段 dsRNA 处理后的尾蚴，活力和存活率都下降……………..…57 4.6 14-3-3 蛋白与 TH