利用RNAi技术阻抑hTERT及Bi-1双基因表达治疗鼻咽癌的实验研究.pdfVIP

利用RNAi技术阻抑办础丁和曰扛J双基因表达治疗鼻咽癌 的实验研究 中文摘要 【目的】 carcinoma，NPC)是我国华南地区的高发性恶性肿 鼻咽癌(nasopha巧ngeal 瘤，研究表明其发病除与EB病毒感染、化学致癌物有关外，与遗传易感基因也 有密切的关系。近年来，fNA干扰(RNAinterferenCe，RNAi)的研究进展非常 迅速，这项技术极有可能用于肿瘤临床治疗。本研究拟从基因治疗的角度出发， 首先在细胞水平上研究以RNAi的方式抑制人鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中人端 reverse 粒酶末端逆转录酶(h啪antelomer裙etr锄scriplase，Jll陋足丁)和BaX抑制因 立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型从动物整体水平研究以I斟Ai方式抑制上述两个靶基因 后基因表达的变化和对肿瘤生长的影响，从而探讨治疗鼻咽癌的新策略。 【方法】 首先，用以前筛选构建的重组质粒：即以pcDNA3．1(+)为载体构建的含T7启 2000(Lip)将各 重组质粒转染至鼻咽癌细胞株CNE．2内，并用流式细胞术(FCM)检测转染率； 用MTT法观察干扰载体及转染试剂对CNE．2细胞生长增殖的影响；测量Caspa鸵．3 活性并结合FCM来检测细胞凋亡；用Real．TimePCR法检测shIⅢA重组质粒对 ^珏础嘟Bf．J基因表达的抑制效果；用Westem-blot观察抑制相关基因后其蛋白质 表达的变化；采用Hoechst33258染色，并用荧光显微镜观察鼻咽癌细胞形态学的 变化：用细胞创伤愈合实验观察细胞迁移能力的变化；用软琼脂克隆形成实验观 察细胞克隆形成能力。 其次，建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型；用上述重组质粒与Lip的混合物瘤内注 ．1． 射后测量肿瘤体积及计算肿瘤生长抑制率，绘制生长曲线；用HE染色观察瘤组 织病理改变：用Real．timePCR法检测各重组质粒作用瘤组织后五陋R瘌曰f．J基因 mRNA表达情况；用免疫组化检测各重组质粒作用瘤组织后hTERT和Bi．1蛋白的 表达情况；并用TUNEL法检查肿瘤组织细胞凋亡。 【结果】 组的CNE．2细胞生长增殖能力降低，其中shRNA．TR．Bi．1组的生长增殖能力最低 显微镜下可见部分鼻咽癌细胞出现典型的凋亡形态学变化；与未处理组相比， 显下调(Po．01)且蛋白的表达也相应减弱。细胞的迁移能力、克隆形成能力均 有所降低，其中以shRNA．TR．Bi．1组更明显(尸O．05)。 体内观察结果：成功建立鼻咽癌移植瘤模型：与未处理组、Lip组和 病理性改变， 以shRNA．TR．Bi．1组更明显； 蛋白表达也相应减弱。 【结论】 Lip介导靶向作用人^您足卿B乒J基因的重组干扰质粒在体外能特异、有效 地阻抑目的基因的表达，鼻咽癌细胞株CNE．2的增殖、迁移，克隆形成能力受到 一定的抑制，出现明显的细胞凋亡；在体内同样也能阻抑靶基因的表达，鼻咽癌 移植瘤的生长减慢。 【关键词】 RNA干扰：鼻咽肿瘤；J|I死R乃胙J『 ．2． Gene for^7船丁and6扣jGene TherapyInvestigation Expression Inhibitionon Carcinoma Nasopharyngeal Abstract 【objective】 oneofthemostcommon in carcinoma(NPC)is maligmancies Nasopharyngeal