实时荧光定量PCR的标记分类及应用.docVIP

实时荧光定量PCR的标记分类及应用 张莹（温州医学院仁济学院生物技术三班，0819040062） 摘要：实时荧光定量PCR（real-time,quantitative PCR）技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的新型核酸定量检测、分析技术。它通过在PCR扩增反应过程中加入荧光物质，使得对反应过程的实时监控成为可能。它具有实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及反应后不需电泳检测等优点，已逐步成为分子生物学研究中的重要工具。 关键字：荧光定量 PCR 应用 聚合酶联反应（polymerase chain reaction, PCR）技术是1985年开始出现的一项基因检测技术。由于PCR技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在，不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限。对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向[1-3]。定量PCR（quantitative PCR,Q-PCR）先后出现了多种方法，目前为止，其中结果最为可靠的就是实时荧光定量PCR（Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time Q-PCR）。 1996年，实时荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司首先推出。这项技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性[4,5]。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质 有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数[5]。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量[5~7]。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 2、 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类 目前，Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种，也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测，这些方法有着相近的灵敏度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。 2.1 SYBR green I染料 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的扩增完全同步。其优点是对模板没有选择性，使用方便，非常方便，但也易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，可以通过溶解曲线的分析，优化反应条件[8]。 2.2 Taqman 探针 目前在Real-time Q-PCR中最广泛使用的Tagman系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5-3活性所降解，探针的5端有一荧光报告基团，3端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5端得报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获，针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底