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2. 蛋白质三维结构测定 根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：（1）应用X射线晶体衍射图谱法（X-ray crystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；（2）应用核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。 利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。 图11-11 X射线晶体衍射的基本原理 核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radio frequency, RF）辐射的物理过程。 近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。 图11-12 NMR测定蛋白质三维结构的基本过程 其它方法可以测定溶液中蛋白质分子的局部构象，但很难获得蛋白质分子完整的三维结构，在应用上存在较大的局限性。 第二节 蛋白质结构预测 蛋白质三维结构很大程度上决定了蛋白质的功能，因此如何获得蛋白质的结构并对之基序分析研究是现代分子生物学的重要课题。目前应用X射线晶体衍射法和NMR法已测定出1万多种蛋白质及其复合物的结构，但与已测得的30多万中蛋白质序列相比，还有很大的差距，大大地影响了人们对蛋白质结构和功能关系的研究。因此发展一种不依赖实验而又有一定准确性的理论蛋白质结构预测方法显得格外重要，近年来在这个方面取得了很多重要的成果。 蛋白质结构的理论预测方法都是建立在氨基酸的一级结构决定高级结构的理论基础上，大致分为以下三类。 一．比较建模法（comparative modeling method） 比较建模法是基于知识的蛋白质结构预测方法，又称为同源结构预测，是根据大量已知的蛋白质三维结构来预测序列已知而结构未知的蛋白质结构。 按照目前的定义，若待模型构建蛋白质的序列与模板序列经比对（alignment）后的序列同源性（sequence identity）在40%（也有人认为在35%）以上，则它们的结构可能属于同一家族，它们是同源蛋白（homology），可以用同源蛋白模型构建的方法预测其三维结构。因为它们可能是由同一种蛋白质分化而来，它们具有相似的空间结构，相同或相近的功能。因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白质的结构，就可以预测其它一些序列已知而结构未知的同源蛋白的结构，可以用同源模型构建的方法预测未知蛋白质的三维结构。 同源蛋白模型构建（模建）的步骤： 1. 目标蛋白序列与目标序列的匹配：应用FASTA或BLAST搜索软件，在PIR、SWISSPROT或GENEBANK等序列库中按序列同源性挑选出一些同源性比较高的序列，然后把挑选出的序列与目标序列基序多重匹配，得到模板结构等价位点套的初始集合。 2. 根据模板结构构建目标蛋白结构模型：在已确定的模板结构等价位点套的初始集合的基础上，旋转每一个模板的结构，使它们相互间的位置尽可能多地重叠在一起。不同两个模板在空间中若复合一定的重叠距离标准，那它们相互之间的关系就是等价位点。许多这样的等价位点构成了等价位点套。 叠合结束后，即得到了同源蛋白的结构保守区（SCRs），以及相应的基架结构（framework）。模板结构匹配后，一般还要用得到的同源体的SCRs的第一条序列与目标序列匹配，挑选出目标序列上的高相拟区，定义为目标蛋白的SCRs。 Homology、UQANTA/CHARM、COMPOSER、CONSENSUS、MODELLER和Collar extension等软件和方法可以用于目标蛋白结构模型的构建。 3. 对模建结构基序优化和评估：同源结构模建（预测）得到的蛋白质结构模型，通常含有一些不合理的原子间接触，需要对模型进行分子力学和分子动力学优化，消除模型中不合理的接触。另外，模型中有些键长、键角和二面角也有可能不合理，也需要检查评估。PROCHECK和PROSA II等软件常用于完成这类工作。 二．反向折叠法 反向折叠法是近年来发展起来的一种比较新的方法。它可以应用到没有同源结构的情况中，且不需要预测二级结构，即直接预测三级结构，从而可以绕过现阶段二级结构预测准确性不超过65%的限度，是一种有潜力的预测方法。 反向折叠法的主要原理是把未知蛋白的序列和已知的结构进行匹配，找出一种或几种匹配最好的结构作为未知蛋