日本脑炎病毒核衣壳蛋白酵母双杂交诱饵载体构建和自激活检测.pdfVIP

·中文论著摘要· 日本脑炎病毒核衣壳蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及 自激活检测 目 的 构建JEVC蛋白编码基因的酵母双杂交诱饵载体，并检测其蛋白表达产物对 酵母细胞有无毒性及对酵母细胞内报告基因有无自激活效应，为筛选及验证JEV C蛋白相互作用相关蛋白奠定实验基础。 材料与方法 一、实验材料 1、质粒、载体、菌株、细胞 质粒pMD—JC由本实验室构建保存，所选表达载体pMDl9-Tsimple购自 TaKaRa公司；大肠杆菌感受态细胞E．coliCellsJMl09购自TaKaRa公 Competent 司，用于重组质粒构建、转化；酵母菌Y2H 验。 2、主要试剂 PCR用DNA聚合酶(Code No．DR010S)、质粒小剂量提取试剂盒(Code No．DV801A)、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(CodeNo．DV805A)、酶促反应DNA T4连接酶(CodeNo．DR6023)、限制性 片断纯化试剂盒(CodeNo．DV807A)、DNA 霉素、卡那霉素购自Sigma公司，琼脂糖购自TaKaRa公司，用于质粒转化及电 泳分析；酵母培养基、各种氨基酸缺陷培养基、X．Q．gal、金担子素、50％聚乙二 醇3350、10x醋酸锂等购自Clontech公司，用于酵母菌Y2HGold感受态细胞的制 备、质粒转化酵母感受态细胞及酵母氨基酸缺陷筛选；酵母总蛋白提取试剂盒 rCode Western．blotting分析。 二、实验方法 1、诱饵质粒pGBKT7．JC构建、转化及鉴定。 Gold 感受态细胞。 3、经酵母氨基酸缺陷培养及表现型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞毒性。 4、经酵母氨基酸缺陷培养及表现型筛选检测诱饵蛋白酵母细胞内报告基因自 激活效应。 5、Western-blotting法检测诱饵蛋白BD—JC的表达。 实验结果 l、诱饵质粒pGBKT7一JC构建及鉴定 重组质粒pGBKT7一JC经EcoRI／BamHI酶切后电泳分析，得到381bp与7．3kb 大小的两个片段，与预期一致；测序分析JEVC蛋白编码基因与发表的序列完全 相符，构建成功的诱饵质粒命名为pGBKT7．JC。 Gold感 2、质粒pGBKT7．JC与载体pGBKT7分别转化酵母菌株Y2H 受态细胞 Y2H 两组缺陷培养基上均可见大小均匀阳性菌落生长。 3、诱饵蛋白毒性检测 2 均O．8。 4、诱饵蛋白自激活检测 缺陷培养基上未见菌落生长。 5、Western．blotting法检测诱饵蛋白BD．JC的表达 pGBKT7一JC蛋白样品约在35KDa处可见目的条带。 ：口结论◆匕 C蛋白编码基因。 1、成功构建的酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC含有JEV Gold感受态细胞且其表达的 2、诱饵质粒pGBKT7．JC成功转化入酵母菌株Y2H 诱饵蛋白BD—JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应。 关键词 脑炎病毒亚组，日本；病毒蛋白；酵母双杂交技术；质粒构建；诱饵蛋自 3 ·英文论著摘要·