氯胺酮对发育期海马神经元凋亡的影响和机制研究.pdfVIP

中文摘要 氯胺酮对发育期海马神经元凋亡的影响及机制研究 摘 要 第一部分新生大鼠海马神经元原代无血清培养、鉴定与形态观察 目的：建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得 高纯度、高活力的海马神经元；观察原代海马神经元形态学特点，测定细 胞生长曲线。 方法：取新生24h内SD乳鼠，断头取脑，于预冷D．hanks玻璃皿中， 剥离两侧海马，机械分离，移入离心管，离心弃上清，加入Accutase酶消 离心弃上清，加入含10％FBS的DMEM液，吹打成细胞悬液。转至塑料培 养瓶中，放入培养箱经差速贴壁1h，收获贴壁速度较胶质细胞慢的神经元， 吹打后以0．4％台盼蓝染色计数活细胞并调整悬液的细胞密度，按 l×l 半量换液，并在倒置相差显微镜下观察神经元生长情况。取培养7d神经元， 每隔两天测吸光度值，绘出生长曲线。 结果：1刚接种的海马神经元呈圆形，体积小、透亮、呈悬浮状态， 培养3h后开始贴壁，接种20h后可见大部分细胞已贴壁，细胞形态多呈 梭形、三角形，长出细长突起，长短不一。3d后胞体饱满，多呈梭形， 胞浆丰富，细胞聚集成团，突起较前明显增长、增粗，连接成网络。7～10d 神经元胞体最丰满，周围光晕明显，突起交织成更加稠密的网络，突起增 粗增长且光晕明显，立体感增强。20d后神经细胞开始退化，细胞边缘光 晕变淡，突起开始退缩，部分细胞核固缩明显。2原代培养海马神经元， 在荧光倒置显微镜下鉴定，计算海马神经元纯度为94．2％士3．6％，能够满 足进一步的实验要求。3原代海马神经元生长曲线测定显示，海马神经元 体外培养条件下经历了生长潜伏期(2~4d)，对数生长期(4~14d)，后进入 生长平台期(14~16d)，细胞生长处于停滞状态。 中文摘要 结论：1原代SD乳鼠海马神经元，培养10d后细胞形态趋于成熟。 相差显微镜下形态呈锥体形、梭形、三角形。2原代培养海马神经元免疫 海马神经元培养经历生长潜伏期、对数生长期和平台期。 第二部分氯胺酮对发育期海马神经元活力和凋亡的影响 目的：不同浓度的氯胺酮培养不同时间，采用MTT法测定氯胺酮对 发育期海马神经元活性的影响；采用流式细胞技术测定不同浓度氯胺酮培 观察凋亡情况。 值。每次实验设空白对照组，即原代培养基。细胞活力=(实验组．空白 组)／(对照组．空白组)。根据MTT结果，取原代培养4．5d海马神经元，在 6孔板培养体系中加入不同浓度氯胺酮，继续培养12h，制备标本，上流 果，前期培养及分组同流式检测各组。 结果：1氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有时间和浓度的交互作用 忙6．227，PO．01)。在不同作用时间下，氯胺酮对神经元活力的影响具 处理不同时间后无显著性差异。当作用时间相同时，不同浓度的氯胺酮对 照组相比3001埘和lmM氯胺酮在各个作用时间上均具有显著性差异， 凋亡率显示，各浓度氯胺酮处理12h对海马神经元凋亡率的影响具有显著 浓度有统计学差异，且凋亡率随浓度的增加而增加。细胞周期的检测结果 显示，各浓度氯胺酮处理12h对海马神经元细胞周期的Go／G1、S和增殖 中文摘要 浓度的增加，Go／Gl期细胞比率逐渐下降，S期细胞比率和PI逐渐增高， 3 的细胞核逐渐增多，部分染色质高度凝聚、边缘化，1000ⅢM时细胞核甚 至裂解为碎块，产生凋亡小体。 结论：氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有浓度及时间依赖性，随着 浓度的增加及作用时间延长，氯胺酮对神经元毒性作用逐渐增强，以lmM 增加。氯胺酮可促进海马神经元由G0／Gl期进入S期，但不能进入GE／M 期，细胞增殖阻滞于S期。 第三部分氯胺酮对发育期海马神经元钙震荡的影响 目的：以离体发育期海马神经元为研究对象，探讨氯胺酮对发育期海 马神经元胞内自发钙振荡的影响与机制。 AM工作液37oC孵育30 分钟以去除细胞表面的非特异性染色。将孵育有Fluo．4AM细胞爬片置于 激光共聚焦显微镜特制的灌流槽中，共聚焦显微镜下调焦平面，使海马神 经元能清晰显示，用氩离子激光器激发荧光，在激光扫描共聚焦显微镜下 对细胞XYT平面进行扫描，扫描频率为1次／s，采用连续扫描的方式记 培养基中)，待药物作用lmin后，观测药物对神经元钙振荡振幅和频率 的影