热休克法制备效树突状细胞肿瘤疫苗治疗小鼠乳腺癌.pdfVIP

究生： 马腾 业： 肿瘤学 师：李宝江教授 中文摘要 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，当前，乳腺癌的治 疗主要治疗手段包括手术治疗、化疗、放疗及内分泌治疗，即便如此，术后仍有很高的 复发率，预后仍不理想。近年来，生物治疗逐渐受到人们重视，人们开始利用制备肿 瘤疫苗的方法治疗恶性肿瘤。肿瘤疫苗因其以较低的抗原刺激就能激发强烈的免疫反 应、肿瘤特异性、自体耐受和安全性以及长时间的免疫记忆能避免肿瘤复发等优点被 越来越多的用来治疗各种恶性肿瘤，并且取得了良好的效果【I捌。同样，以树突状细胞 cells，DC)为基础构建的乳腺癌治疗疫苗也成为乳腺癌生物治疗的研究热点； (dendritic 其中，直接利用裂解的肿瘤细胞抗原负载树突状细胞制备的肿瘤疫苗因肿瘤抗原易于 制备和疗效确切，被广泛应用；人们利用裂解肿瘤细胞抗原负载树突状细胞制备的肿 瘤疫苗治疗非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、结 肠直肠癌【34J等，在临床试验中均取得了一定效果，但是，因为多数肿瘤的免疫原性很 弱，使得树突状细胞不能正常呈递抗原以有效激活特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tcell s，CTL)，从而限制了树突状细胞肿瘤疫苗的疗效不能进一步提高，为了提高肿 瘤的免疫原性，提高树突状细胞肿瘤疫苗的效价，人们想到了在抗原中加入佐剂(如热 休克蛋白、绿脓杆菌菌毛等)的方法，并且已经在体外实验中取得了可喜的成果【5,6,7】。 热休克蛋白(HSPs)又称分子伴侣，是机体细胞受到各种应急刺激时产生的一类保护 性蛋白，参与有关蛋白的折叠、装配、细胞内运输及蛋白质降解等过程，调节这些蛋 白的活性和功能，具有免疫佐剂和激活DC的功能【8J。本研究我们分别采用热休克法 和冻融法制备小鼠乳腺癌树突状细胞肿瘤疫苗，并对采用不同方法制备的肿瘤疫苗治 疗小鼠乳腺癌进行疗效对比。 目的 Clone 1．研究利用粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophagestimulating necrosis factor-a，TNF．a)联合培养小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞。 1 2．分别利用热休克和冻融法处理小鼠EMT6乳腺癌细胞，研究所获得的乳腺癌细 胞裂解物当中热休克蛋白．70(HotShockProtein-70，HSP70)的表达情况。 3．将获得全细胞抗原与培养的树突状细胞混合培养，制备小鼠树突状细胞乳腺癌 肿瘤疫苗。分别利用以上制备的不同的小鼠乳腺癌树突状细胞肿瘤疫苗治疗小鼠移植 瘤，对比热休克法和冻融法制备的小鼠乳腺癌树突状细胞肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的疗效。 4．2l天时处死小鼠，称量小鼠肿瘤体积及质量，并取血比较不同治疗组小鼠血清 和白细胞介素一12(P70)(Interleukin一12，IL一12(P70))的水平。 I 方法 1．定期通过光学显微镜观察培养的树突状细胞的形念，利用流式细胞仪对树突状 细胞的表型进行分析。 2．用免疫组织化学法(immunohistochemicalmethod)检测不同方法制备的小鼠乳腺 癌肿瘤细胞中HSP70的表达量的不同。 3．建立小鼠乳腺癌动物模型并分组，应用不同的树突状细胞肿瘤疫苗进行治疗。 4．至21天，，处死小鼠，称量小鼠肿瘤体积和质量，并取血利用酶联免疫吸附测 immunosorbent linked 定(enzyme INF-丫、IL一2、IL-12(P70)的水平。 结果 L通过对骨髓源性树突状细胞形态的观察及流式细胞仪(flow